PD-L1 抗体的 Fc 糖工程利用 Fcγ 受体提高抗肿瘤功效

更新时间：2023-03-06 23:02:10作者：

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使用抗 PD-L1 单克隆抗体 (mAb) 的免疫检查点封锁用于治疗多种癌症。这些 mAb 是否具有诱导 Fc 介导的效应子功能的最佳 Fc 支架尚不清楚。在这里，Cohen-Saban等人. 研究抗 PD-L1 对 FcγR 的参与如何促进抗肿瘤免疫。他们证明，有益的 FcγR 信号通路未被 FDA 批准的 mAb 参与，并使用两种方法来增加激活与抑制 FcγR 通路激活的比率。阻断抑制性 FcγRIIB 并结合抗 PD-L1 可改善抗肿瘤反应。同样，IgG1 Fc 区的非岩藻糖基化改善了抗肿瘤反应，这是由于肿瘤微环境的改变。这些发现确定了两种改善抗 PD-L1 疗法的方法，并表明非岩藻糖基化 IgG1 支架可使抗 PD-L1 mAb 更有效。—人机界面

抽象的

FDA 批准的抗 PD-L1 单克隆抗体 (mAb) 具有 IgG1 同种型，其支架为野生型（例如 avelumab）或 Fc 突变型且缺乏 Fcγ 受体 (FcγR) 参与（例如 atezolizumab）。IgG1 Fc 区与 FcγRs 结合的能力的变化是否使 mAb 具有更好的治疗活性尚不清楚。在本研究中，我们使用人源化 FcγR 小鼠来研究 FcγR 信号转导对人抗 PD-L1 mAb 抗肿瘤活性的贡献，并确定 PD-L1 mAb 的最佳人 IgG 支架。我们在使用具有野生型和 Fc 突变 IgG 支架的抗 PD-L1 mAb 治疗的小鼠中观察到相似的抗肿瘤功效和可比的肿瘤免疫反应。然而，野生型抗 PD-L1 mAb avelumab 的体内抗肿瘤活性通过与 FcγRIIB 阻断抗体联合治疗得到增强，共同给药以克服 FcγRIIB 在肿瘤微环境 (TME) 中的抑制功能。我们进行了 Fc 糖工程以从 avelumab 的 Fc 连接聚糖中去除岩藻糖亚基，以增强其与激活 FcγRIIIA 的结合。与亲本 IgG 相比，使用 Fc-afucosylated 版本的 avelumab 治疗也增强了抗肿瘤活性并诱导更强的抗肿瘤免疫反应。无岩藻糖基化 PD-L1 抗体的增强作用依赖于嗜中性粒细胞，并与 PD-L1 频率降低有关与亲本 IgG 相比，使用 Fc-afucosylated 版本的 avelumab 治疗也增强了抗肿瘤活性并诱导更强的抗肿瘤免疫反应。无岩藻糖基化 PD-L1 抗体的增强作用依赖于嗜中性粒细胞，并与 PD-L1 频率降低有关与亲本 IgG 相比，使用 Fc-afucosylated 版本的 avelumab 治疗也增强了抗肿瘤活性并诱导更强的抗肿瘤免疫反应。无岩藻糖基化 PD-L1 抗体的增强作用依赖于嗜中性粒细胞，并与 PD-L1 频率降低有关⁺骨髓细胞和 TME 中 T 细胞浸润增加。我们的数据表明，目前 FDA 批准的抗 PD-L1 单克隆抗体的设计并未最佳地利用 FcγR 通路，并提出了两种增强 FcγR 参与以优化抗 PD-L1 免疫疗法的策略。

介绍

使用抗 PD-1 和 PD-L1 单克隆抗体 (mAb) 治疗性阻断 PD-1/PD-L1 轴是癌症免疫疗法的标志 (1 )。除了这些免疫检查点 mAb 的 Fab 介导的活性外，它们的 Fc 结构域组成可能会因为 Fcγ 受体 (FcγR) 通路的参与而影响它们的抗肿瘤活性 (2 )。FcγR 通路活性的差异导致抗 PD-1 与抗 PD-L1 mAb 诱导的不同体内结果。小鼠抗 PD-1 mAb 不依赖于 FcγR，并且 FcγR 相互作用的存在会损害它们的抗肿瘤活性 ( 2 – 4 )。相比之下，当引入激活 FcγR 结合活性时，抗 PD-L1 小鼠单克隆抗体显示出增强的抗肿瘤作用 ( 2 ,5). This FcγR-dependent pathway synergizes with the FcγR-independent PD-1/L1–blocking activity of anti–PD-L1 mAbs, thereby augmenting their therapeutic efficacy.
Now, three PD-L1 mAbs have been granted U.S. Food and Drug Administration (FDA) approval for the treatment of various types of skin, lung, bladder, breast, liver, and kidney cancers (6–8). Avelumab is an anti–PD-L1 human immunoglobulin G1 (IgG1) mAb capable of interacting with and activating various human FcγR signaling pathways, resulting in antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity/phagocytosis (ADCC/P). Two other PD-L1 mAbs used in the clinic, atezolizumab and durvalumab, are mutated in their Fc domain, which abolishes FcγR binding, thereby preventing Fc-mediated effector functions (9). 尽管所有三种 mAb 均表现出临床活性，但没有数据可用于直接比较它们的相对功效。因此，不知道 avelumab 是否受益于 FcγR 介导的机制，如针对小鼠 PD-L1 mAb 所描述的那样。此外，目前尚不清楚用于人 PD-L1 mAb 的最佳 IgG 支架。
在这项工作中，我们在人源化 FcγR 小鼠模型 ( 10 ) 中表征了两种抗 PD-L1 药物 avelumab 和 atezolizumab 的 Fc 结构域参与的效应子功能。此外，我们通过直接比较几种人 IgG 支架的体内活性，评估了是否可以利用 FcγR 通路进一步提高其体内抗肿瘤活性。这些结果使我们能够确定人抗 PD-L1 mAb 治疗活性的最佳 Fc 变体。

结果

FDA 批准的 PD-L1 mAb 的 IgG 支架不参与有益的 FcγR 通路

为了评估人 PD-L1 mAb 的 Fab 和 Fc 介导的活性，我们首先评估了 avelumab（野生型）和 atezolizumab（Fc 突变型）的小鼠和人 PD-1/PD-L1 结合和阻断活性。两种 mAb 都与鼠 PD-L1 发生交叉反应，PD-1/PD-L1 轴的阻断程度在物种之间具有可比性，与商业抗鼠 PD-L1 克隆相似，广泛应用于临床前研究（图 1，A 和 B，以及图 S1A）( 2 )。考虑到这些人 mAb 与小鼠配体的交叉反应性和 PD-1/PD-L1 通路的人鼠高度相似性，我们预计表达鼠 PD-1/PD-L1 的小鼠可用于模拟这些人 PD-L1 mAb 对 PD-L1 的抑制作用。

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然而，小鼠和人类的 FcγR 结构和表达谱以及 IgG 亚类与 FcγR 的结合亲和力不同 ( 11 , 12 )。因此，先前确定的小鼠 PD-L1 mAb 的 Fc-FcγR 相互作用的作用与人类临床转化的相关性有限。为了克服这一限制，我们使用了先前描述的人源化 FcγR 小鼠品系，其中表达人类 FcγR 而不是其小鼠直系同源物的方式更精确地概括了人类的人类细胞和组织表达模式 (10 , 13 – 17 )). 为了评估 IgG 主链对人 PD-L1 mAb 体内抗肿瘤活性的影响，我们通过将 atezolizumab 切换为IgG1 野生型支架并将 avelumab 切换为 FcγR，生成了两个 Fc 版本的 avelumab 和 atezolizumab（图 1C ） -结合无效 IgG1 (N297A) 支架。切换这两种 mAb 的 IgG 骨架不会改变它们的 Fab 介导的 PD-L1 结合（图 S1B）。我们比较了这两种 Fc 变体在具有已建立的 MC38 腺癌肿瘤的 huFcγR 小鼠中的治疗效果，这揭示了每种 PD-L1 mAb 的两种 IgG 支架对肿瘤生长控制的相似作用（图 1D ）). 为了测试 huIgG1 和 huIgG1-N297A 的相似功效是否是由于后者与 FcγRI 的残留结合，我们比较了 avelumab IgG1-N297A 在 huFcγR 小鼠和 FcγR 基因敲除 (KO) 小鼠中的抗肿瘤活性。在两种小鼠品系中观察到相似水平的肿瘤生长控制，表明该 Fc 变体对 FcγR 的残余参与不会介导其抗肿瘤活性（图 S1C）。IgG1 和 IgG-N297A 抗 PD-L1 治疗后肿瘤微环境 (TME) 成分的表型显示对不同免疫细胞群的频率有相似的影响（图 1E 和图S1、D 到 H）。
这些结果表明，人 PD-L1 mAb 的 IgG1 野生型和 IgG1-N297A 支架在不影响其作用方式的情况下产生相似的效力。具有临床意义的是，这些数据表明，尽管 avelumab (IgG1) 有可能在体外参与 Fc 效应子功能 ( 18 )，但它不会参与有益的 FcγR 通路作为其体内抗肿瘤活性的一部分。

FcγRIIB 是抗-PD-L1 IgG1 抗肿瘤活性的抑制检查点

我们的结果表征了人 IgG1 和 PD-L1 mAb 的 IgG1-N297A 变体具有相似的抗肿瘤活性，这与之前在相同肿瘤模型中对小鼠 PD-L1 mAb 的观察结果形成对比。在之前的研究中，与相同 PD-L1 mAb 克隆的 Fc 沉默版本相比，小鼠 IgG2a 亚类（与小鼠 FcγRs 的有效激活相关）导致增强的抗肿瘤活性 (2 )。我们接下来探讨了限制人类 IgG1 亚类参与 FcγR 通路的因素。FcγRIIB 代表唯一的抑制性 FcγR，它直接拮抗激活 FcγR 的免疫刺激细胞内信号（11). 为了评估 FcγRIIB 在肿瘤部位抗 PD-L1 mAb 活性中的潜在参与，我们评估了它在荷瘤 huFcγR 小鼠的 TME、脾脏和引流淋巴结 (dLN) 中不同免疫细胞上的表达模式. 我们发现 FcγRIIB 在树突状细胞 (DC)、巨噬细胞、单核细胞和中性粒细胞的表面高表达，并且与外周器官相比，在 TME 中的 DC 和巨噬细胞上显着上调（图 2A 和图S2， A 到 C）。

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这种表达模式支持抑制性 FcγRIIB 对 TME 中抗 PD-L1 mAb 的 FcγR 依赖性活性产生负面影响的可能性，以及人类 IgG1 同种型缺乏增强的活性。为了检验这一假设，我们将 avelumab（IgG1 野生型）的全身给药与瘤内注射抗 huFcγRIIB 阻断性 mAb（克隆 2B6）相结合。与 avelumab 单一疗法相比，这种组合显着增加了体内治疗效果（图 2B），这意味着 FcγRIIB 抑制了 TME 中 PD-L1 IgG1 的抗肿瘤活性。
我们假设阻断抗 PD-L1 IgG1 与抑制性 FcγRIIB 的相互作用可能会增加其与 TME 中激活 FcγR 的结合，从而增强其抗肿瘤活性。三种激活的 FcγR 在人类细胞中表达——FcγRI、FcγRIIA 和 FcγRIIIA。我们希望确定当 avelumab 与抑制性 FcγRIIB 的结合被阻断时，激活 FcγRs 的哪些成员介导 avelumab 的 Fc 依赖性活性。为了解决这个问题，我们比较了 avelumab 在表达所有激活 FcγR 的小鼠中的活性与阻断抑制性 FcγR（用 FcγRIIB 阻断剂 mAb 处理的 huFcγR 小鼠）及其在仅表达激活 FcγRIIIA 和 FcγRIIIB（CD16A +/+）的小鼠中的^活性CD16B ^+/+转基因小鼠）（图 2C). 通过对表达所有激活 FcγR 的小鼠进行 avelumab 治疗，实现了对肿瘤生长的卓越控制，支持了多个激活 FcγR 通路的潜在作用。因此，FcγRI 和/或 FcγRIIA 可能除了 FcγRIIIA 之外，还参与了在与 avelumab 和抗 FcγRIIB 联合治疗后 FcγR 介导的增强的抗肿瘤反应。
为了预测类似的抑制性 FcγRIIB 依赖性机制是否可能发生在人类患者中，我们评估了 Merkel 细胞癌或肾细胞癌患者在开始使用 avelumab 治疗之前的活组织检查中 FcγRIIB 的表达。我们在这些基线活检中发现 TME 中 FcγRIIB 的高表达（图 2D和图 S2D）。CD68 ⁺巨噬细胞在这些肿瘤中很丰富，我们检测到一部分巨噬细胞在其细胞表面共表达 FcγRIIB。在 avelumab 治疗之前的基线时，FcγRIIB 在患者肿瘤中的这种高表达表明 FcγRIIB 表达也可能降低人类患者的 avelumab 疗效。

抗 PD-L1 的 Fc 非岩藻糖基化介导 FcγR 依赖性增加的抗肿瘤活性

另一种通过抗 PD-L1 IgG1 增加激活抑制性 FcγR 信号的方法是修饰其 Fc 区以提供增加的激活/抑制性 FcγR 结合亲和力比 (A/I)。为此，我们通过从 Fc 连接的聚糖 (aFuc-IgG1) 中去除岩藻糖亚基，生成了 avelumab 的糖工程版本，这种修饰已知可选择性地将 IgG1 结合亲和力提高 11 倍至激活的 FcγRIIIA/B ( 19 ) . 我们将 avelumab 的非岩藻糖基化 Fc 糖型部分富集至 71.86%，而亲本 IgG1 制剂中为 5.47%（图 3A）和图。S3、A 和 B）。比较了 aFuc-IgG1、IgG1 和 IgG1-N297A Fc 版本的 avelumab 与所有人类 FcγR 的结合。相对于 IgG1，aFuc-IgG1 仅表现出与 FcγRIIIA 和 FcγRIIIB 的结合增加，而除了与高亲和力 FcγRI 的轻微结合外，没有检测到任何 FcγR 与 IgG1-N297A 的结合（图 3B ）). avelumab 的这些 Fc 修饰不影响其 Fab 介导的 PD-L1 结合（图 S1A 和 S3C）或其体内半衰期（图 S3D）。因此，比较这些 Fc 变体的体内活性可以直接准确地读出 FcγR 参与对测试活动的贡献。为此，我们比较了 avelumab 的 IgG1 和 aFuc-IgG1 版本在 huFcγR 小鼠中的抗肿瘤活性，作为治疗 MC38 肿瘤的单一疗法，以及作为 B16-F10 黑色素瘤的联合疗法，以及基于 B16-F10 肿瘤的疫苗分泌粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子 (GM-CSF) (GVAX)。我们观察到与用 IgG1 处理的小鼠相比，用 aFuc-IgG1 处理的小鼠的抗肿瘤活性显着改善（图 3C）和图。S3D）。aFuc-IgG avelumab 相对于 IgG1 avelumab 的这种优越活性在所有 FcγR 缺陷的 KO 小鼠中被废除（图 3D），表明 aFuc-IgG1 avelumab 的活性提高依赖于 FcγR 相互作用。

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接下来，我们测试了将 aFuc-IgG1 avelumab 与 huFcγRIIB 阻断性 mAb 结合是否可以进一步提高其治疗活性，如对 IgG1 变体所观察到的那样。当两种变体与抗 huFcγRIIB 组合时，与亲本 IgG1 avelumab 相比，aFuc-IgG1 avelumab 没有获得附加的抗肿瘤反应（图 3E）。这表明抗 PD-L1 与抗 huFcγRIIB 的组合，以及通过非岩藻糖基化修饰的 Fc，通过冗余的 FcγR 依赖机制起作用，以增强抗 PD-L1 IgG1 抗肿瘤活性，两者都允许改善体内抗肿瘤功效。我们的结果将 aFuc-IgG1 鉴定为抗 PD-L1 的改进型人 IgG 支架，可提高 FcγR 介导的治疗效果。

Afucosylated avelumab 降低TME 中PD-L1 ^{+骨髓细胞亚群的频率}

髓源性抑制细胞 (MDSC) 是癌症免疫和免疫治疗反应的有效抑制剂。^{我们评估了 avelumab Fc 变体对粒细胞 MDSC（Ly6C低}Ly6G ⁺）和单核细胞 MDSC（Ly6C^低或 Ly6C^高Ly6G ^-）的影响。我们通过抗 PD-L1 治疗确定了对抑制性人群频率的显着 Fc 依赖性影响。与未治疗小鼠相比，用 aFuc-IgG1 治疗导致这些小鼠中粒细胞 MDSC 显着增加，单核细胞 MDSC 显着减少，这在 TME 中观察到，但在脾脏中没有观察到（图 4A ）和图。S4A). 为了更好地表征 aFuc-IgG1 avelumab 变体介导的 Fc 效应子功能，并了解其对其靶细胞的直接影响，我们比较了治疗对TME 中不同 PD-L1 ^{+细胞的影响。}我们使用不与 avelumab 竞争 PD-L1 结合的抗 PD-L1 mAb（图 S4B）来评估用avelumab Fc 变体治疗后 TME 中PD-L1 ^{+细胞的频率。}

图 4。Afucosylated avelumab 降低了TME 中PD-L1 ^{+骨髓细胞亚群的频率。}
( A ) 在 IgG1 和 aFuc-IgG1 avelumab 治疗开始后 8 天，从 huFcγR 小鼠解剖的 MC38 肿瘤中 Ly6G Ly6C MDSC 百分比的流式细胞术分析。每个点代表两次技术重复的单个鼠标平均值，数据绘制为小提琴图。执行了带有 Tukey 事后检验的单向方差分析。* P ≤ 0.05，** P ≤ 0.01。n = 6. ( **B ) PD-L1** ⁺非免疫细胞 (CD45 ^- )、PD-L1 ⁺总免疫细胞 (CD45 ⁺ ) 和 PD-L1 ⁺的流式细胞术分析在 IgG1 和 aFuc-IgG1 avelumab 治疗开始后 8 天，从荷瘤 huFcγR 小鼠身上切下的 MC38 肿瘤中的骨髓细胞。每个点代表一只小鼠，数据绘制成小提琴图。Kruskal-Wallis 检验或单向方差分析与 Tukey 的事后检验是在正态性的基础上进行的。* P ≤ 0.05，*** P ≤ 0.001。n = 12 或 13。( C ) 在接种 8 天后从荷瘤 huFcγR 小鼠中分离出的 MC38 TME 中的不同细胞显示了 PD-L1 的 MFI。每个点代表一只小鼠，数据以平均值±SEM 的形式绘制；n = 13。

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^{PD-L1 +} CD45 ^-肿瘤和基质细胞的百分比不会随着 avelumab 的 IgG1 或 aFuc-IgG1 变体而改变，从而否定了 FcγR 介导的亲本或 Fc-消除 PD-L1 ⁺基质和癌细胞的可能性增强的 avelumab 变体（图 4B和图 S4D）。相比之下，我们发现用 aFuc-IgG1 avelumab 治疗的 huFcγR 小鼠肿瘤中 PD-L1 ⁺ CD45 ^{+免疫细胞的频率和}^绝对数量显着降低，这主要归因于 CD11b + 频率的显着降低骨髓细胞。我们根据 PD-L1 表面表达分析了不同的骨髓细胞群，发现 aFuc-IgG1 avelumab 治疗的最显着效果是 PD-L1 ⁺ DC 频率的降低。其他免疫细胞的频率，包括 PD-L1 ⁺单核细胞、巨噬细胞和自然杀伤 (NK) 细胞，并未受到治疗的显着影响。在用 aFuc-IgG1 变体治疗后PD-L1 ⁺髓样细胞的减少与治疗基线时CD45 ^{+髓样免疫细胞的 PD-L1 表达水平高于 CD45}^-肿瘤和基质细胞一致（图 4C）。
总之，这些发现表明 aFuc-IgG1 avelumab 增强的抗肿瘤活性与 Fc 介导的 TME 中具有抑制表型的特定 PD-L1 ⁺免疫髓细胞亚群频率降低有关( 20 – 23 )，并提出了一种机制，涉及ADCC/P 由 aFuc-IgG1 avelumab 增强，介导这些 PD-L1 ^hi免疫细胞的消除。

Afucosylated avelumab 诱导 FcγR 依赖性 TME 免疫调节

2999), 表明由治疗介导的抗肿瘤效应 T 细胞反应的参与。TME 中 T 细胞丰度的增加与dLN 中CD4 ⁺和 CD8 ⁺ T 细胞的同时减少有关（图 5C），但与脾脏（图 S5B）无关，这表明 T 细胞从淋巴结迁移到T 细胞激活后的肿瘤。TME 中的骨髓细胞亚群组成也受到 afucosylated avelumab 治疗的影响（图 5D）和图。S5、C 和 D 和 H) 与 IgG1 相比。在 TME 中观察到 DC 和巨噬细胞频率的降低，这与 T 细胞频率的相对增加有关。afucosylated avelumab 特有的最显着影响是在嗜中性粒细胞中发现的，这是 TME 中的稀缺种群，约占免疫细胞的 0.5%，其相对频率和绝对数量均显着增加（图 5D 和图S5， C 和 D）。当治疗荷瘤 FcγR KO 小鼠时，这种对 TME 成分的 Fc 依赖性影响被消除，支持对 FcγR 通路参与的依赖（图 5E和图 S5、E、F 和 I）。

图 5。用 afucosylated avelumab 治疗后 FcγR 依赖性 TME 免疫调节。
IgG1 或 aFuc-IgG1 avelumab 治疗开始后 8 天， MC38 肿瘤中的 ( A ) 绝对免疫细胞数，( B ) MC38 中的绝对淋巴细胞数，和 ( C ) 从荷瘤 huFcγR 小鼠解剖的 dLN 中的淋巴细胞组成的流式细胞术分析. 每个点代表一只小鼠，数据绘制成小提琴图。( D ) 在 IgG1 和 aFuc-IgG1 avelumab 治疗开始后 8 天，从荷瘤 huFcγR 小鼠（左）或 FcγR KO 小鼠（右）解剖的 MC38 肿瘤中免疫细胞群相对频率的流式细胞术分析。数据绘制为条形图，平均值为±SEM。对于所有地块，执行了带有 Tukey 事后检验的单向方差分析。* P ≤ 0.05，** P ≤ 0.01，*** P ≤ 0.001。n = 5 到 7。

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中性粒细胞介导 afucosylated avelumab 的优越抗肿瘤活性

TME 包含异质性嗜中性粒细胞群，它们可以通过多种机制促进肿瘤生长或介导抗肿瘤免疫，从而在肿瘤中发挥双重作用 ( 24 – 29 )。因此，我们试图描述由 aFuc-IgG1 avelumab 治疗驱动的嗜中性粒细胞表型的变化。我们对免疫细胞 (CD45 ⁺) 从治疗开始后第 8 天用 IgG1 或 aFuc-IgG1 avelumab 治疗的小鼠肿瘤和未治疗对照的肿瘤中分离。无监督聚类揭示了不同的免疫细胞群，根据标记基因进行注释（图 S6、A 和 B），包括中性粒细胞。比较每个细胞群的两种 Fc 变体治疗的差异基因表达分析表明，抗 PD-L1 治疗对嗜中性粒细胞、两个单核细胞亚群和 CD8 T 细胞有不同的影响（图 6A 和图 S6C ）。从 aFuc-IgG1 avelumab 治疗的肿瘤中分离的嗜中性粒细胞具有较低的抑制表型，如较低的 PD-L1 表达所示（图 6B）). 在 aFuc-IgG1 avelumab 治疗的肿瘤中，与补体和主要组织相容性复合体 II (MHC-II) 抗原呈递相关基因（例如C1qb、Cd74和H2-Aa（图 6C ））相关基因的上调进一步证明了一种转变从具有抑制状态的嗜中性粒细胞转变为更具促炎性的嗜中性粒细胞。因此，通过基因集富集分析 (GSEA)，我们确定了与 aFuc-IgG1 avelumab 中性粒细胞相关的抗原呈递、补体和适应性免疫反应，而来自 IgG1 avelumab 治疗的肿瘤的中性粒细胞上调了与抑制核因子 κB 相关的程序（NF-κB）信号和伤口愈合（图 6D). 与 scRNA-seq 数据一致，使用流式细胞术进行的蛋白质水平分析显示，在 aFuc-IgG1 avelumab 治疗的肿瘤中，相对较大部分的中性粒细胞对与抑制性中性粒细胞表型 PD-L1 相关的蛋白质表达呈阴性（图.S6D）和 Arg1（图 S6E）。

图 6。中性粒细胞介导 afucosylated avelumab 的卓越抗肿瘤活性。
( A )按细胞类型（x轴）划分的 DEG 数（y轴）。IgG1 以红色显示，IgG1-aFuc 以蓝色显示。( B ) 在 IgG1 和 aFuc-IgG1 avelumab 治疗开始后 8 天，从荷瘤 huFcγR 小鼠中解剖的 MC38 肿瘤中的中性粒细胞上 PD-L1 的对数标准化基因表达。* P ≤ 0.05，Wilcoxon 秩和检验。( C ) 在 IgG1 和 aFuc-IgG1 avelumab 治疗开始后 8 天，从荷瘤 huFcγR 小鼠中解剖的 MC38 肿瘤中的嗜中性粒细胞中的高度可变基因。*图表针对z*得分基因表达进行了颜色编码。( D) 在 IgG1 和 aFuc-IgG1 avelumab 治疗开始后 8 天，GSEA 对从荷瘤 huFcγR 小鼠身上切下的 MC38 肿瘤中的中性粒细胞进行了 GSEA。图表采用颜色编码以用于归一化富集分数 (NES)；气泡大小描述了 -log ₁₀错误发现率 - 调整后的P值。对于 (A) 至 (D)，*n =* 3 至 5。 ( E ) 中性粒细胞耗竭实验的肿瘤攻击和治疗方案。( F和G ) huFcγR 小鼠接种 MC38 肿瘤细胞，并用 aFuc-IgG1 (F) 或 IgG1 avelumab (G) 与抗 Gr1 或 IC 联合治疗。左：肿瘤随时间进展。右图：治疗开始后第 11 天的个体小鼠。数据绘制为平均值±SEM。曼-惠特尼检验。* *P≤0.05* 。n = 15. iv，静脉内；sc，皮下；ip，腹膜内。

为了验证显示肿瘤中性粒细胞中抗原呈递相关基因富集的 RNA 数据，我们还测量了 dLN 中性粒细胞中的 MHC-II 蛋白表达。我们观察到，与未处理的对照相比，使用无岩藻糖基化抗 PD-L1 mAb 处理后，dLN 中性粒细胞中MHC-II ⁺ /MHC-II ⁻比率显着增加（图 S6F）。这支持了嗜中性粒细胞在促进抗肿瘤免疫力同时充当抗原呈递细胞以激活 CD4 ⁺T 细胞的可能作用，如先前在某些条件下所证明的那样 ( 28 , 30 )。这些数据也与我们在 aFuc-IgG1 处理的小鼠中观察到的肿瘤内 CD4 ⁺ T 细胞频率增加一致。
为了测试在嗜中性粒细胞中观察到的表型变化是否有助于提高 afucosylated avelumab 的功效，我们使用市售的大鼠抗 Gr1 耗竭抗体耗尽了 huFcγR 小鼠中的嗜中性粒细胞。我们在注射后 4 小时和 4 天验证了血液、dLN 和肿瘤中Ly6C^低Ly6G ⁺嗜中性粒细胞的消耗（图 S6、G 和 H）。因为 anti-Gr1 Ab 靶向 Ly6C/Ly6G，我们评估了 Ly6C ⁺单核细胞是否受该方案影响，发现 Ly6C ^{+的百分比}细胞未受影响（图 S6、I 和 J），这意味着在这种情况下存在中性粒细胞特异性耗竭。我们没有在接受治疗的小鼠中观察到副作用，例如体重减轻（图 S6K）。接下来，用 IgG1 或 afucosylated avelumab 联合抗 Gr1 或同种型对照 (IC) 治疗 huFcγR 荷瘤小鼠，并追踪肿瘤体积动力学（图 6E ）。嗜中性粒细胞的缺失损害了非岩藻糖基化 IgG1 avelumab 的优异抗肿瘤活性，但不损害亲本 IgG1 avelumab（图 6，F 和 G）。这意味着嗜中性粒细胞在介导非岩藻糖基化 IgG1 变体活性增强中起着重要作用。
人中性粒细胞表达 FcγRI、FcγRIIA 和 FcγRIIIB；后者是一种糖基-磷脂酰肌醇连接的人中性粒细胞特异性受体，没有细胞内信号域。FcγRIIIB 本身不能通过中性粒细胞参与 IgG 介导的细胞毒性，但可以增加中性粒细胞膜上 IgG-抗原免疫复合物的局部浓度，这可能通过其他激活这些细胞上的 FcγRs，FcγRI 或 FcγRIIA 激活细胞内信号和细胞毒活性。除了 FcγRIIIA 结合外，Fc 无岩藻糖基化增强了 IgG 与中性粒细胞特异性 FcγRIIIB 的结合。我们希望确定增强的 aFuc-IgG1 avelumab 与中性粒细胞 FcγRIIIB 的结合是否是其增强的抗肿瘤活性所必需的。因此，我们比较了用 FcγRIIB 阻断性 mAb 处理的人源化 FcγR 小鼠中的 aFuc-IgG1 avelumab 活性，^+/+ CD16B ^+/+小鼠。我们在这些不同的环境中观察到相似的活性，表明 FcγRIIA 和/或 FcγRI 不会增强 aFuc-IgG1 avelumab 的抗肿瘤活性（图 S6L）。这表明 aFuc-IgG1 avelumab 与 IgG1 avelumab 相比增强的肿瘤控制不涉及嗜中性粒细胞中的直接 FcγR 信号传导，并且嗜中性粒细胞的有益作用是由上述 TME 中 FcγR 介导的变化诱导的。

讨论

尽管抗 PD-L1 mAb 的 Fc 区在增强抗肿瘤反应中的作用已在多项临床前研究中得到强调 ( 2 , 3))，这些观察结果与临床使用中人类 PD-L1 IgG 活性的相关性尚未得到充分解决。在这里，我们证明 avelumab 的 IgG1 子类不能最佳地参与 TME 中有益的人类 FcγR 通路。我们进一步证明，增加 PD-L1 mAb 激活与抑制 FcγR 通路的比例可以增强该 IgG 亚类介导的抗肿瘤免疫。我们描述了两种通过抗 PD-L1 治疗增强 FcγR 通路的实用方法：(i) 与 FcγRIIB 阻断性 mAb 联合治疗和 (ii) IgG Fc 支架修饰，以非岩藻糖基化 IgG1 的形式增加 FcγRIIIA 结合。
与相同 PD-L1 mAb 克隆的人 IgG1 亚类相比，Fc 沉默 N297A 突变体中观察到的相似抗肿瘤功效与我们之前观察到的小鼠 IgG2a 和大鼠 IgG2b 亚类与其 Fc 沉默相比抗肿瘤活性增强的观察结果形成对比变体或具有激活 FcγRs 遗传缺陷的小鼠 ( 2). 小鼠 IgG2a 和人 IgG1 同种型被广泛认为是同源亚类，因为它们具有比每个物种中的其他 IgG 亚类更高的参与 Fc 效应子功能的能力，例如 ADCC 和 ADCP。然而，这些亚类在其 FcγR 结合特性方面表现出显着差异。小鼠 IgG2a 和大鼠 IgG2b 同种型对小鼠激活 FcγR 表现出显着的优先结合能力（A/I 分别为 69 和 40）（2、31），而人 IgG1 的结合率较低（FcγRIIIA / FcγRIIB 结合率5) ( 10). 这种 A/I 比率决定了许多类型的 mAb 的细胞毒活性，并且可能导致这些观察到的跨物种差异，这是由于与小鼠 IgG2a 相比，TME 中的抑制性 FcγRIIB 对人 IgG 的显性影响。此外，TME 中小鼠与人 FcγR 在效应单核细胞和巨噬细胞上的表达和分布存在显着差异 ( 12 , 32 )。IgG-FcγR 相互作用和 FcγR 分布和功能的这些跨物种差异突出了使用完全人源化的 FcγR-IgG 体内系统进行研究以更好地模拟人类 IgG 的预期活性的优势 (33 , 34 )。
FcγRs 在增强靶向免疫检查点的其他 mAb 的抗肿瘤活性方面的重要性已在之前的几项研究中得到强调 ( 2 , 13 , 35 – 39 )。激活和/或抑制 FcγRs 通路的参与被证明有助于这些免疫疗法的效力。激活 FcγRs的Fc 参与显示通过抗 CTLA4（35、37、38、40、41 ）、抗 OX-40（39）、抗4-1BB诱导Ab介导的_{瘤内 T reg}消除( 42 ), 和抗 GITR ( 38）单克隆抗体。相反，抑制性 FcγRIIB 的参与为 Ab 交联提供了一个惰性支架，以增强激动性 mAb 活性，主要是那些靶向肿瘤坏死因子受体的抗体，例如抗 CD40 mAb (36 , 43 , 44 )。因此，许多检查点 mAb 可以在体内通过多种机制发挥作用（例如，检查点阻断和 T _reg耗竭），这可以协同它们的活性以获得最佳治疗效果。同样，我们的研究表明，Fab 介导的 PD-1/L1 阻断和 Fc 介导的骨髓亚群调节是抗 PD-L1 mAb 参与的两种作用模式。
Fc 区在几个 FcγR 介导的损害抗肿瘤活性的途径中的重要性，如抗 PD-1 mAb 的情况，在我们和其他人的研究结果中得到强调 (2 , 3 )。因此，为每种 mAb 选择合适的 Ab 支架（选择性参与或避免特定 FcγR 通路的 IgG 亚型或 Fc 变体）对于实现最佳抗肿瘤活性极为重要。此外，这些已确定的 FcγR 通路为 Fc 工程检查点 mAb 提供了提高其活性的机会。临床试验中的例子包括 ipilimumab 的无岩藻糖基化变体，这是一种抗 CTLA-4 mAb，经修饰可增强 T _reg耗竭 ( 45)，以及 selicrelumab (2141-V11) 的 Fc 修饰变体，一种增强 FcγRIIB 介导的交联的 CD40 激动剂 ( 13 )。我们的研究支持临床开发和评估 avelumab 和其他 PD-L1 mAb 的非岩藻糖基化变体作为第二代检查点抑制性 mAb 的基本原理，具有增强的 Fc 效应子功能以增强对肿瘤生长的控制。
FcγRIIB 降低了 mAb 介导的免疫疗法的功效 ( 46 )，FcγRIIB 拮抗剂与抗癌 mAb 的组合被证明可以增加抗癌细胞毒性 mAb 免疫疗法的 FcγR 依赖性抗肿瘤作用 ( 47 )。我们的结果表明巨噬细胞在人 Merkel 细胞和肾细胞癌病变中表达 FcγRIIB，这与之前关于人黑色素瘤活检的报告一致 ( 37 )。巨噬细胞在 Fc 介导的治疗性 mAb 活性中的主导作用及其在小鼠和人类肿瘤中的高丰度和 FcγRIIB 上调暗示巨噬细胞在 Fc 介导的 avelumab 活性中的可能作用，并强调这些巨噬细胞相关通路是潜在的治疗反应的生物标志物 ( 48). 这种 FcγRIIB 表达模式和 avelumab 增强的抗肿瘤活性与肿瘤内注射 FcγRIIB 阻断剂的组合表明这种 FcγR 对 avelumab 活性具有抑制作用。治疗性 FcγRIIB 特异性拮抗性 mAb 已经开发出来，我们的研究支持对这些可用试剂与 avelumab 或其他抗 PD-L1 IgG1 mAb 联合给药进行临床评估 (49 )。
^{用 avelumab 治疗的晚期尿路上皮癌患者的生存获益与两个或多个 FCGR2A H131}和 FCGR3A ^V158 FcγR 等位基因的存在相关，这些等位基因对 IgG1 结合具有高亲和力 ( 50 )。此外，在该试验中，TME 中表达 FcγR 的细胞，包括 NK 细胞、单核细胞和巨噬细胞，与 avelumab 治疗组的存活率提高相关，进一步支持了 avelumab 在部分患有这些 Fc 效应器允许的条件。我们研究中使用的 huFcγR 小鼠携带低亲和力 FCGR2A ^R131和 FCGR3A ^F158FcγR等位基因。我们表明，avelumab 作为单一疗法不会在这些小鼠中建立的肿瘤模型中参与有益的 FcγR 通路，除非 Ab 是无岩藻糖基化的。总之，我们的临床前发现和引用的临床数据一致表明，抗 PD-L1 IgG1 与 FcγR 的低亲和力等位基因的结合强度不足以通过该 mAb 提供抗肿瘤 Fc 效应子功能。通过 IgG 支架的 Fc 工程，或通过阻断与抑制性 FcγRIIB 的竞争结合，需要增加激活的 FcγR-IgG1 结合相互作用，以提供改进的抗肿瘤反应. 还预测，使用 afucosylated avelumab 治疗将使没有高亲和力 FcγR 等位基因或具有少量高亲和力 FcγR 等位基因的患者亚群受益，
aFuc-IgG1 avelumab 活性提高的特点是 TME 中骨髓亚群的改变。最显着的影响包括减少 PD-L1 ⁺ DC 和 MDSC 的子集以及中性粒细胞频率和细胞状态的调节。肿瘤相关的炎症性 PD-L1 ⁺ DC 可促进免疫抑制并在抗肿瘤反应中发挥关键作用 ( 22 , 51 , 52). 因此，我们认为 afucosylated avelumab 通过与表达 FcγRIIIA 的效应细胞（如巨噬细胞和 NK 细胞）结合，通过 Fc 介导的这些 PD-L1 抑制细胞类型的减少来促进抑制性较低的 TME。这种治疗导致促炎性淋巴细胞对肿瘤的浸润增加，可能介导了肿瘤细胞的杀伤。
与抑制性 DC 和 MDSC 的频率降低相反，在用 aFuc-IgG1 avelumab 治疗后中性粒细胞频率增加。这表明中性粒细胞不是 Fc 改造的 PD-L1 mAb 消除的目标。此外，我们的数据表明它们不受 FcγRIIIB 参与和细胞内 FcγR 信号传导激活的直接影响。相反，我们提出嗜中性粒细胞受到 aFuc-IgG1 avelumab 治疗在 TME 中介导的促炎反应的旁观者效应的影响。据报道，嗜中性粒细胞有助于促进肿瘤或抗肿瘤活性。中性粒细胞的抗肿瘤功能包括防止转移形成 ( 24 )、介导早期肿瘤生长的抑制 ( 25 )、刺激 T 细胞反应 (26 , 27 )，以及抗原处理和肿瘤肽向 T 细胞的呈递 ( 28 , 29 )。我们的数据表明，嗜中性粒细胞可能会受到 aFuc-IgG1 avelumab Fc-FcγR 与其他免疫细胞相互作用的间接影响。这些相互作用导致 PD-L1⁺抑制细胞减少，随后 TME 的促炎状态增加，从而调节中性粒细胞数量。
这项研究的一个局限性是使用小鼠临床前模型来预测全人类 Abs 的临床反应。为了尽量减少这一警告，我们使用人源化 FcγR 小鼠来更好地概括人类 IgG-FcγR 相互作用，并验证我们在相关临床肿瘤活检中观察到的小鼠肿瘤中 FcγRIIB 的上调。然而，在肿瘤免疫方面存在其他显着的跨物种差异，可能会损害我们临床前发现的临床转化潜力。
我们一起解决了该领域中一个尚未解决的问题，即先前在小鼠中发现的 FcγR 通路与临床使用的人 PD-L1 Abs 活性的相关性。我们研究了人类 FcγR 和 Fc 介导的效应子功能对人类 FDA 批准的 PD-L1 mAb 活性的贡献。我们的研究得出结论，PD-L1 mAb 的 Fc 工程以增加对激活 FcγR 的亲和力是优化肿瘤免疫治疗的有效策略。这与之前用于设计此类疗法（atezolizumab 和 durvalumab）以消除它们与 FcγR 的相互作用的 Fc 工程策略相反。

材料和方法

学习规划

本研究的目的是阐明人 PD-L1 mAb 疗法如何募集 FcγR ⁺TME 中的免疫细胞增强其抗肿瘤活性。我们的目标是生成和表征当前 FDA 批准的抗 PD-L1 药物的下一代 Fc 变体，这些药物具有更高的疗效，可以很容易地推进临床评估。我们使用流式细胞术、免疫荧光染色、scRNA-seq 和体内肿瘤挑战设计并进行了实验。在这项研究中，我们使用了 FcγR 人源化小鼠，它概括了人类 Fc 受体的活性和表达模式，使我们能够克服人类抗体和鼠类受体之间的跨物种反应。我们还使用了人类肿瘤切片的临床相关性。每个图的图例中都标明了样本大小和生物复制的数量。在一些情况下，实验被合并。任何带有n 的实验2999)，和 (c) 处死时没有肿瘤的小鼠（图 S6、G 和 I）。(ii) 在流式细胞术实验中，当 (a) 人口太少而无法进行可靠的门控（少于 300 个细胞），(b) 由于技术问题（珠子计数差异）无法进行细胞定量时，样本被排除在分析之外) 和 (c) 在极少数情况下异常样本与组的趋势有显着差异（图 4B和无花果。S4D 和 5S，A 到 C）。(iii) 在酶联免疫吸附测定 (ELISA) 实验中，由于技术问题排除了两个浓度（图 S1A）。在研究中显示的所有体内实验中，动物被随机分配并根据肿瘤大小、性别和年龄分配到实验组，如材料和方法中所述。肿瘤测量由对每只动物的治疗组不知情的研究人员进行。在研究中显示的所有体内实验中，数据收集一直进行到达到相关机构动物护理和使用委员会 (IACUC) 批准的人道终点，或者直到小鼠在接种肿瘤后 100 天内无肿瘤。

老鼠

所有动物研究均经魏茨曼科学研究所 IACUC 批准，许可证号为 05620720-2 和 03910422-3。FcγR KO（mFcγRa^无效）、huFcγR 小鼠（mFcγRA^无效、hFcγRI ⁺、hFcγRIIA ^R131+、hFcγRIIB ⁺、hFcgRIIIA ^F158+和 hFcγRIIIB ⁺）和 CD16A + ^/+ CD16B ^+/+小鼠（mFcγRa^无效、hFcγRI^无效、hFcγRIIA^无效hFcγRIIB ^null、hFcγRIIIA ^F158+和 hFcγRIIIB ⁺) 由洛克菲勒大学的 J. Ravetch 提供并由内部维护。所有体内实验均在魏茨曼科学研究所无特定病原体的设施中进行，使用 8 至 12 周龄的雌性和雌性动物，随机分配到实验组。

细胞系

MC38 和 B16-F10 GVAX 由洛克菲勒大学的 J. Ravetch 提供。B16-F10 购自美国典型培养物保藏中心 [研究资源标识符 (RRID)：CVCL_0159]。

肿瘤挑战和治疗

将肿瘤细胞系维持在 37°C 和 5% CO _{2 的}加湿培养箱中，并在含有 25 mM Hepes、1% l-谷氨酰胺、10% 胎牛血清、1% 青霉素-链霉素、1%非必需氨基酸和 1% 丙酮酸。将 MC38 (2 × 10 ⁶ ) 或 B16F10 (4 × 10 ⁵ ) 细胞皮下植入小鼠左侧，由对治疗组不知情的研究者每 2 至 3 天用电子卡尺测量肿瘤体积。使用公式 ( L ² * l )/2 计算体积，其中L是最大直径，l是最小的直径。小鼠按肿瘤大小（第 0 天）随机分组，并按照每个实验的图例中所述进行治疗。在第 0、3 天，用 50 μg 抗 PD-L1 mAb IgG1、IgG1-N297A、afucosylated IgG1（avelumab 或 atezolizumab）、25 μg 抗人 FcγRIIB 或对照磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 处理 huFcγR 小鼠和 6，除非另有说明。GVAX (1 × 10 ⁶ ) 被照射 (150 Gy) 并在第 0 天和第 6 天皮下植入 B16-F10 荷瘤小鼠的右侧。治疗开始后监测小鼠，并在肿瘤大小达到魏茨曼研究所时处死小鼠科学 IACUC 限制。

体内中性粒细胞耗竭

Anti-mouse Ly6G/Ly6C (clone RB6-8C5) (Bio X Cell, catalog no. BE0075, RRID: AB_10312146) and the corresponding rat IgG2b IC (clone LTF-2) (Bio X Cell, catalog no. BE0090, RRID: AB_1107780) were injected intravenously through the lateral tail vein, as indicated in the figure and/or legend. Depletion efficiency was assessed by flow cytometry analysis.

Human tumor tissues

Meckel cell carcinoma and renal cell carcinoma paraffin tumor sections were provided by A. Alva from the University of Michigan. Sections were 4 μm thick. Personal patient information was not reported.

Immunofluorescence staining

在用二甲苯、EtOH 和 PBS 脱石蜡后，对石蜡包埋切片进行免疫荧光染色。在室温 (RT) 的加湿室中，用 CAS-Block (Thermo Fisher Scientific, ZY-008120) 封闭所有载玻片 60 分钟。所有抗体均在 CAS-Block 中稀释。载玻片在 4°C 下与针对 CD68 的初级抗体（Abcam，目录号 ab213363，RRID：AB_2801637）、CD66b（Abcam，目录号 ab197678）、抗 LY75/DEC-205（Abcam，目录号 ab124897）孵育过夜，RRID：AB_10976058）和抗 CD32B（Abcam，目录号 ab77093，RRID：AB_1523300）以 1:200 稀释。将载玻片与生物素缀合的抗山羊 IgG（Jackson ImmunoResearch Labs，目录号 705-065-147，RRID：AB_2340397）以 1:100 的稀释度在加湿室中室温孵育 90 分钟。然后将载玻片与 Cy3 缀合的驴抗兔二抗（Jackson ImmunoResearch Labs，目录号 711-165-152，RRID：AB_2307443）以 1:200 稀释或链霉亲和素 Cy5（Jackson ImmunoResearch Labs，目录号 016- 170-084，RRID：AB_2337245）以 1:150 稀释，室温下 60 分钟。DAPI（4'，6-二脒基-2-苯基吲哚）染色在室温下以 1:1000 的稀释度进行 60 分钟。所有载玻片均使用 Thermo Fisher Scientific Shandon Immu-Mount 安装。使用带有 20×/0.8 M27 Plan-Apochromat 物镜的 Zeiss LSM 880 Airyscan 共聚焦显微镜对载玻片进行成像。6-diamidino-2-phenylindole) 染色在 1:1000 的稀释度下在 RT 下进行 60 分钟。所有载玻片均使用 Thermo Fisher Scientific Shandon Immu-Mount 安装。使用带有 20×/0.8 M27 Plan-Apochromat 物镜的 Zeiss LSM 880 Airyscan 共聚焦显微镜对载玻片进行成像。6-diamidino-2-phenylindole) 染色在 1:1000 的稀释度下在 RT 下进行 60 分钟。所有载玻片均使用 Thermo Fisher Scientific Shandon Immu-Mount 安装。使用带有 20×/0.8 M27 Plan-Apochromat 物镜的 Zeiss LSM 880 Airyscan 共聚焦显微镜对载玻片进行成像。

抗人 PD-L1 和抗人 FcγRIIB 抗体及其 Fc 变体的产生

avelumab 或 atezolizumab 的可变重链区和轻链区是根据它们已公布的序列合成的。抗人 FcγRIIB 的可变重链区（克隆 2B6）由 J. Ravetch（洛克菲勒大学）提供。亲代抗体的可变区序列被克隆并插入到具有人 IgG1 或人 kappa（atezolizumab 和抗人 FcγRIIB）/lambda (avelumab) Fc 骨架的哺乳动物表达载体中。为了产生人 IgG1 N297A Fc 结构域变体，使用特异性引物进行定点诱变（avelumab：5'-GAGAAGAGCAGTACGCCTCAACTTACCGCGTAG-3'、5'-CTACGCGGTAAGTTGAGGCGTACTGCTCTTCTC-3'；atezolizumab：5'-GAGAAGAACAATACGCCTCAACCTATCGCGTTG-3'，3'-CAACGCGATAGGTTGAGGCGTATTGTTCTTCTC-5') 根据制造商的说明通过聚合酶链反应 (PCR) (Agilent Technologies) 进行。突变的质粒序列通过直接测序（生命科学核心设施，魏茨曼科学研究所）进行验证。为了产生 Abs，将 Ab 重链和轻链表达载体瞬时转染到 Expi293 细胞（Thermo Fisher Scientific，目录号 A14527）中。
为了生成人 IgG1 无岩藻糖基化 Fc 结构域变体，在转染后 1 天添加200 μM 2-脱氧-2-氟-1-岩藻糖 (Biosynth Carbosynth)。上清液中分泌的 Abs 通过 Protein G Sepharose 4 Fast Flow (GE Healthcare) 纯化。纯化的抗体在 PBS 中透析并无菌过滤 (0.22 μm)。通过 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳和考马斯染色评估纯度。通过质谱法评估非岩藻糖基化形式的百分比，估计为 75%。

酶联免疫吸附测定

使用重组小鼠 PD-L1（义和生物，编号 50010-M08H 或 BPS Bioscience，编号 71117-1）、人 PD-L1（义和生物，编号. 10084-H08H 或 BPS Bioscience 编号 71104-1）和人 FcγR（人 FCGR1A，编号 10256-H08H；人 FCGR2A，编号 10374-H08H；人 FCGR2B，编号 10259-H08H；人 FCGR3A，编号10389-H08H；和人 FCGR3B，编号 11046-H08H1，义翘神州）。96 孔 ELISA 半面积高结合板（Greiner Bio-One，编号 675061）在 4°C 下用重组 PD-L1 蛋白（1 μg/ml）或人 FcγR（2 μg/ml）的复制品包被过夜. 所有后续步骤均在室温下进行。洗涤后，用含 2% 牛血清白蛋白（BSA；对于 PD-L1 蛋白）或 10% BSA（对于人 FcγRs），然后与连续稀释的 IgG（稀释度在图中标明，并且在相关封闭溶液中制备）。洗涤后，将板与辣根过氧化物酶缀合的抗人 IgG（Jackson ImmunoResearch Labs，目录号 109-035-088，RRID：AB_2337584）孵育 1 小时。对于 ELISA 抑制测定，在封闭非特异性位点后，将板与连续稀释的 IgG 和 1 μg/ml 小鼠（BPS Bioscience，编号 71118）或人 PD-1-生物素（BPS Bioscience，编号 71109- 1) 在含有 2% BSA 的 1× PBS 中。洗涤后，将板与辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素（编号 405210，BioLegend）孵育 1 小时。使用单组分底物溶液（三甲基硼）进行检测，并通过添加 0.18 M 硫酸停止反应。使用 SpectraMax Plus 分光光度计（Molecular Devices）立即记录 450 nm 处的吸光度，并减去阴性对照样品的背景吸光度。测试了以下抗体：avelumab（内部制备）、atezolizumab（内部制备）和抗小鼠 PD-L1（克隆 10F.9G2）（Bio X Cell，目录号 BE0101，RRID：AB_10949073）。

药代动力学测定

向 MC38 荷瘤 huFcγR 小鼠注射抗 PD-L1 IgG1（avelumab）、IgG1-N297A 或无岩藻糖基化 IgG1（每只小鼠 300 μg），并在指定时间点放血。血清储存在-80°C，直到收集到所有时间点。血清中的 Ab 浓度使用标准比色 ELISA 测定法测定。简而言之，用重组人 PD-L1（1μg/ml；Sino Biological，编号 10084-H08H）包被测定板，并在 4°C 下孵育过夜。然后用含有 10% 胎牛血清的 1× PBS 将板封闭 2 小时。将系列稀释的血清加入板中，并将板孵育2小时。洗涤后，将板与辣根过氧化物酶缀合的抗人 IgG（Jackson ImmunoResearch Labs，目录号 109-035-088，RRID：AB_2337584）孵育 1 小时。使用 SpectraMax Plus 分光光度计（Molecular Devices）立即记录 450 nm 处的吸光度，并减去阴性对照样品的背景吸光度。基于已知浓度和稀释因子的校准曲线计算每个时间点的血清中 Ab 浓度。

组织处理

将外周血收集到 K2E EDTA 管（Becton Dickinson）中，然后将细胞在室温下染色 30 分钟。然后用 1 ml BD FACS 裂解液（Becton Dickinson）孵育 10 分钟裂解红细胞，然后用荧光激活细胞分选（FACS）缓冲液（1×PBS，含 0.5% BSA 和 2 mM EDTA）以 1200 rpm 洗涤分析前。通过 70 μm 尼龙细胞过滤器解剖脾脏和淋巴结。对于脾脏，通过与红细胞裂解缓冲液（Zymo Research）孵育 5 分钟来裂解红细胞，并用 PBS 洗涤。将肿瘤机械切割成小碎片并转移到含有脱氧核糖核酸酶 I（0.33 mg/ml；罗氏）和 Liberase TL（0.27 mg/ml；罗氏）的 GentleMACS C 管（Miltenyi Biotec）中的 Dulbecco 改良伊格尔培养基（DMEM）（生物工业） ). 下一个，肿瘤在 GentleMACS Octo Dissociator (Miltenyi Biotec) 中分离两次，然后将细胞悬浮液在 37°C、25 rpm 下进一步孵育 40 分钟。孵育后，肿瘤在 GentleMACS 中进行两个额外的解离循环。在第二个解离周期后，肿瘤通过 70-μm 尼龙细胞过滤器分散并用 PBS 洗涤。

流式细胞仪

如上所述制备单细胞悬浮液。对于表面染色，将细胞置于 PBS 中的 U 形 96 孔板（Thermo Fisher Scientific）中。细胞先用 LIVE/DEAD Fixable blue dead cell stain (Thermo Fisher Scientific) 染色，然后用 PBS 洗涤一次，然后重悬于 25 μl 含人 TruStain Fc 块 (BioLegend) 的 FACS 缓冲液中，避光孵育 15分钟在 RT。表面抗原在 FACS 缓冲液中在冰上黑暗中染色 30 分钟。然后，将细胞用FACS缓冲液洗涤两次，重悬于150μl FACS缓冲液中，并通过流式细胞术分析。对于细胞内 Foxp3 和精氨酸酶 1 染色，根据制造商的说明，使用真核转录因子缓冲液套装 (BioLegend) 进行了额外的染色步骤。所有样本均通过 CytoFLEX LX (Beckman Coulter) 进行分析。对于细胞定量，我们使用 CountBright 绝对计数珠进行流式细胞术（Thermo Fisher Scientific，目录号 C36950），并根据制造商说明计算绝对数。除非另有说明，否则细胞群由以下标记定义：DC：CD45⁺ , NK1.1 ^- , CD11b ⁺ , CD11c ⁺ , MHC-II ⁺ , F4/80 ^- ; 巨噬细胞：CD45 ⁺、NK1.1 ^-、CD11b ⁺、MHC-II ⁺、F4/80 ⁺、Ly6C ^-、Ly6G ^-；单核细胞：CD45 ⁺、NK1.1 ^-、CD11b ⁺、Ly6C ⁺、Ly6G ^-、F4/80 ^-、CD11c ^-；中性粒细胞：CD45 ⁺ , NK1.1 ^- , CD11b ⁺ , Ly6G ⁺ , Ly6C^低, F4/80 ^- ; NK细胞：CD45 ⁺ , NK1.1 ⁺ ; CD8 T 细胞：CD45 ⁺、CD3 ⁺、CD8 ⁺、CD4 ^-；CD4 T 细胞：CD45 ⁺、CD3 ⁺、CD4 ⁺、CD8 ^-、Foxp3 ^-；T _regs : CD45 ⁺ , CD3 ⁺ , CD4 ⁺ , CD8 ^- , Foxp3 ⁺. 为了确定精氨酸酶 1、PD-L1 和 CD32B 的表达，使用了以下抗体：精氨酸酶 1 (A1exF5)、PD-L1 (10F.9G2) 和 CD32B (2B6)。以下商业抗体用于通过流式细胞术确定细胞群：抗小鼠 CD45（克隆 30-F11），BioLegend，目录号。103151，无线电识别码：AB_2565884；抗小鼠 CD11c（克隆 N418），BioLegend，目录号。117320，无线电识别码：AB_528736；抗小鼠 MHC-II（克隆 M5/114.15.2），BioLegend，目录号。107636，无线电识别码：AB_2734168；抗小鼠 F4/80（克隆 BM8），BioLegend，目录号。123118，无线电识别码：AB_893477；抗小鼠 CD11b（克隆 M1/70），BioLegend，目录号。101256，无线电识别码：AB_2563648；抗小鼠 Ly6C（克隆 HK1.4），BioLegend，目录号。128012，无线电识别码：AB_1659241；抗小鼠 Ly6G（克隆 1A8），BioLegend，目录号。127645，无线电识别码：AB_2566317；抗小鼠 NK1.1（克隆 PK136），BioLegend，目录号。108741, RRID：AB_2562561；抗小鼠 CD3（克隆 17A2），BioLegend，目录号。100220，无线电识别码：AB_1732057；抗小鼠 CD8α（克隆 53-6.7），BioLegend，目录号。100730，无线电识别码：AB_493703；抗小鼠 CD4（克隆 RM4-5），BioLegend，目录号。100526，无线电识别码：AB_312727；抗小鼠 Foxp3（克隆 53-6.7），BioLegend，目录号。126404，无线电识别码：AB_1089117；抗小鼠精氨酸酶 1（克隆 A1exF5），Thermo Fisher Scientific，目录号。12-3697-82，无线电识别码：AB_2734839；和抗小鼠 PD-L1（克隆 10F.9G2），BioLegend，目录号。124308，无线电识别码：AB_2073556。AB_1089117；抗小鼠精氨酸酶 1（克隆 A1exF5），Thermo Fisher Scientific，目录号。12-3697-82，无线电识别码：AB_2734839；和抗小鼠 PD-L1（克隆 10F.9G2），BioLegend，目录号。124308，无线电识别码：AB_2073556。AB_1089117；抗小鼠精氨酸酶 1（克隆 A1exF5），Thermo Fisher Scientific，目录号。12-3697-82，无线电识别码：AB_2734839；和抗小鼠 PD-L1（克隆 10F.9G2），BioLegend，目录号。124308，无线电识别码：AB_2073556。

单细胞分选

染色后，将细胞洗涤并重悬于冷 FACS 缓冲液（PBS 中的 0.5% BSA 和 2 mM EDTA）中，用荧光团偶联的抗小鼠 CD45 Ab 染色，并通过 70 μm 滤网过滤。分选前，细胞用碘化丙锭染色以排除死亡/垂死细胞。使用 BD FACSAria Fusion 流式细胞仪（BD Biosciences）进行细胞分选，门控 CD45 ⁺排除死细胞和双联体后的细胞。如前所述（PubMed 标识符：34017133），将单个细胞分选到含有 100 μl 裂解液、3 μl 矿物油和用于 scRNA-seq 的 20 nM 条形码化 poly(T) 逆转录引物的 384 孔捕获板中。分选后立即将板旋转下来以确保细胞浸入裂解液中，在干冰上快速冷冻，并在-80°C下储存直至进一步处理。使用 BD FACSDIVA 软件（BD Bioscience）和 FlowJo 软件（FlowJo LLC）分析细胞。

单细胞文库制备

来自分选细胞的 scRNA-seq 文库是使用大规模并行 scRNA-seq 方法 (MARS-seq) (PMID:31101904) 的修改版本制备的。简而言之，来自分选到 384 孔捕获板中的单细胞的聚腺苷酸化 mRNA 在逆转录成 cDNA 的过程中被标记。汇集每个板，将 cDNA 片段化并扩增以生成 Illumina 测序就绪文库。每个板文库都经过质量和 DNA 浓度测试。

读取比对

测序文库以等摩尔浓度汇集，并使用 Illumina NextSeq 500 或 NovaSeq 6000 测序仪以每个细胞 10,000 至 50,000 读数的测序深度进行测序。通过计算相同的唯一分子标识符 (UMI)，将读数浓缩为原始分子。我们使用空井虚假 UMI 检测的统计数据来确保我们用于分析的批次显示出低水平的交叉单细胞污染（小于 3%）。如前所述对 MARS-seq 处理读取。使用 HISAT（版本 0.1.6）将读数映射到小鼠参考基因组 mm10；具有多个映射位置的读取被排除在外。如果使用 UCSC 基因组浏览器将读取映射到外显子以供参考，则读取与基因相关联。

质量控制

根据计数深度 (400 < #UMI)、表达基因数 (200 < #genes) 和线粒体基因含量 (20 > %Mt-) 过滤细胞。不满足后一个阈值的细胞通常无法存活或凋亡。

聚类和注释

Seurat package (version 4.0) ( 53 ) 标准工作流程被用于聚类。简而言之，对 UMI 矩阵进行对数归一化，检测高度可变的基因，并应用主成分分析 (PCA)，然后在 50 个主要成分上构建 K 最近邻图。Louvain 算法用于使用分辨率参数 1 的社区检测。基于标记基因手动注释聚类。

降维

我们使用具有 Seurat ( 53 ) 函数 RunUMAP() 的均匀流形近似和投影 (UMAP)。我们将其应用于批量校正数据。用于计算嵌入的 PC 与用于聚类的 PC 相同。在计算 UMAP 坐标时，我们使用a = 0.5，b = 2 来实现最佳传播。

基因集富集分析

我们应用Broad Institute 开发的GSEA ( 54 ) 来寻找在不同治疗组中富集的基因集。我们提供了由 Seurat 的 FindMarkers() 生成的基因日志_{2 FC 并进行了排序。}我们使用了在 R ( 55 )中实现的 Fast GSEA (“fgsea”) 包。基因集取自小鼠 C5 v5p2 基因本体 (GO) 集合。

差异表达检测

为了找到处理之间的差异表达基因 (DEG)，我们将所有样本的细胞汇集在一起，并使用来自 Seurat ( 53 ) 的 FindMarkers() 对未校正的对数转换归一化计数进行双侧 Wilcoxon 秩和检验。我们考虑了在 >0.05 个细胞中表达的基因，以及 >5 个细胞和 >2 个 UMI 的基因。
标记基因（图 S6A）被选择为倍数变化 > 1.5，Benjamini-Hochberg 调整后的P值 < 0.05，其中呈现了得分最高的基因。图中的 DEG。S6B 被选择为 |fold change > 1.25|，Benjamini-Hochberg 调整后的P值 < 0.05，其中标记了得分最高的基因。

软件和可视化

所有统计分析均使用 R 软件（R 统计计算基金会，维也纳，奥地利）进行。ggplot2 代码包用于大多数图形。

统计分析

使用 FlowJo 软件进行流式细胞术数据分析。所有其他数据分析均使用 GraphPad Prism 9（GraphPad 软件）进行。除非另有说明，否则定量数据表示为平均值±SEM。当该值是从 IC 推导出的 Ab 的荧光强度时，会显示三角几何平均强度 (ΔMFI)。对于每个数据集，使用 Shapiro-Wilk 和/或 D'Agostino-Pearson 检验确认总体和/或总体残差（高斯分布）的正态性。对于正态分布，比较两组时，未配对的双尾学生t测试（双尾，不等方差）用于确定统计显着性；当比较三组时，使用单因素方差分析 (ANOVA) 和 Tukey 事后检验来确定统计显着性。当数据不呈正态分布时，采用非参数检验，两组比较采用Mann-Whitney检验，多重比较采用Kruskal-Wallis加Dunn's post hoc检验。对于生存曲线，使用 Bonferroni 校正阈值进行对数秩检验。统计显着性用以下数字表示：* P ≤ 0.05，** P ≤ 0.01，*** P ≤ 0.001，**** P < 0.0001，ns：不显着。

致谢

我们感谢 I. Sher 提供的艺术品和 S. Schwarzbaum 提供的编辑协助。
资助：这项工作得到了 Rina Gudinski 职业发展主席 (RD)、以色列癌症协会 (RD)、以色列科学基金会 (RD)、莫罗斯综合癌症 (RD)、空乘医学研究所 (RD)、Dwek 研究所的支持癌症治疗研究 (RD)、David E. Stone 和 Sheri Hirschfield Stone 75 周年纪念基金 (RD)、Rising Tide 基金会 (RD)、墨西哥魏茨曼研究所之友协会 (RD)、Miel de Botton (RD)、Garvan- Weizmann Partnership 捐助者 (RD)，Elie Hirschfeld 和 NFBI-Teva 博士 Sarah Schlesinger (RD)。研究金 (NCS)、Maccabim 基金会奖学金 (NCS) 和癌症免疫学 MICC 博士。程序（NCS）。
作者贡献： RD 监督了这项研究并获得了资助。RD 和 NCS 构思并设计了这项研究。RD 和 NCS 撰写了手稿。NCS、AY、TL、RS 和 TF 进行了实验和/或分析了数据。AA 为这项研究提供了资源。IA 监督工作并获得资金。
竞争利益：魏茨曼研究所已提交与这项工作相关的 PCT 专利申请，NCS 和 RD 是该专利的发明人。RD 从 Teva Pharmaceuticals 获得研究资金，并担任 Teva Pharmaceuticals、Nucleai 和 Immunai 的顾问职务。其他作者声明他们没有竞争利益。
数据和材料可用性：单细胞 RNA 测序数据保存在 NCBI GEO，登录号 GSE224011。评估论文结论所需的所有数据都存在于论文或补充材料中。在当前研究期间生成和/或分析的所有数据集均可根据合理要求从相应的作者处获得。

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