摘要:比较了几株白腐真菌在造纸黑液废水中的挂膜生长状况及其对黑液废水的处理效果 .结果表明 ,在 pH 6 .0的废水中添加葡萄糖 1.0 g/L ,酒石酸铵 0 .2 g/L及适量无机盐时 ,黄孢原毛平革菌 (Phanerochaetechrysosporium)和侧耳菌 (Pleurotusostieatus)以及本实验室自选的白腐真菌S2 2的挂膜状况和对黑液废水的处理效果最好 .废水中添加的葡萄糖和酒石酸铵的浓度分别为 1.0g/L和 0 .2 g/L时 ,侧耳菌的挂膜和对黑液废水的处理效果最佳 .S2 2菌在 pH10 .0时其木质素降解率和COD去除率最高 ,分别可达 84 %和 6 9% .黄孢原毛平革菌、侧耳菌和S2 2菌能够在碱性较强的废水中生长挂膜并显著降解木质素 ,表现出对废水很强的适应能力 .生物膜对黑液废水的半连续化处理结果表明了生物膜法的优越性 .

关键词:白腐真菌,黑液废水,木质素,COD

目前我国造纸工业中草类制浆占有很大比重 ,造纸原料经高温碱液蒸煮脱木素后排出的黑液废水是造纸工业最大的污染源 ,已对环境造成极大威胁 .

废水中所含的氯化木素及其降解产物如氯代酚、氯代儿茶酚和齐聚类衍生物等是产生造纸黑液废水毒性和颜色的主要物质 .白腐真菌是自然界中唯一能够降解天然高分子物质———木质素的一类真菌 ,它们对木素类污染物质的独特降解能力和降解机制 ,使得它们在废水脱色和降低COD方面表现出了良好的处理效果 ,从而日益引起人们的重视[1～ 3 ] .黄孢原毛平革菌可利用化学机械法制浆废液中的碳源繁衍 ,对废液中的污染物质具有显著的降解能力[4,5] .

用白腐菌处理蔗渣浆CEH漂白废水和制浆漂白废水 ,可有效地进行脱色[6～ 8] .本文主要考察了 5株不同的白腐真菌在造纸黑液废水中挂膜生长的状况 ,以及对黑液废水中木质素和COD的去除效果 ,并对影响菌株挂膜和木质素降解的碳氮源浓度、无机盐的存在和 pH值等因素进行了研究 ,从而为白腐真菌在造纸黑液废水治理中的实际应用提供了一定的理论依据 .

1 􀀁 材料与方法

1. 1 􀀁 材料
黄孢原毛平革菌( Phanerochaete chrysosp or ium ) 由广州微生物研究所提供, 侧耳菌( Pleur otus os tieatus ) 和香菇菌( Lenti􀀁nus edodes ) 由本院菌种室提供, 变色栓菌( Tr ametes versicolor )由北京中科院微生物研究所提供, 白腐真菌S22 为本实验室筛选菌株. 挂膜用载体为一种齿面空心( 柱状) 塑料悬浮载体.稻草灰法半化学浆浓黑液取自安徽省某制浆造纸厂. 将此浓黑液按20%稀释( 黑液􀀁= 20%) 用于试验, 以下简称黑液废水, 其木质素􀀂为800～ 1 000 mg/ L, 􀀂( COD) = 4 000～ 5 000mg / L, pH 为9. 0～ 10. 0.

1. 2 􀀁 主要仪器
FA1004 电子天平, pHs􀀁3E 数字式pH 计, HQL150B 恒温摇床, TGL􀀁16 高速台式离心机, 752 型紫外光栅分光光度计.

1. 3 􀀁 废水培养基
在黑液废水( 黑液􀀁= 20%) 中添加适量葡萄糖和酒石酸铵( 视具体试验而定) , 􀀂( KH2PO4 ) = 1. 0 g/ L, 􀀂( Mg O4.7H2O) = 0. 5 g/ L.

1. 4 􀀁 白腐菌对黑液废水的处理
配制废水培养基, 调节pH 至所需值. 将28 ∀ 条件下培养5～ 6 d 的菌丝体从斜面转移到含有100 mL 废水培养基的三角烧瓶中, 经匀浆器匀浆, 制成菌悬液. 再将该菌悬液接种到已灭菌的、含载体的150 mL 废水培养基中, 在28 ∀ 下先静置后振荡培养共16 d ( 120 r / mim) , 定期取样, 离心后取上清液测定木质素和COD. 每次实验均以不接种上述菌悬液的废水培养基为对照.

1. 5 􀀁 分析方法
以分光光度法测定黑液废水中的木质素含量( D280 nm) [ 9] ,以标准方法测定黑液废水的 CODCr![ 1 0] .

2 􀀁 结果与讨论

2. 1 􀀁 不同菌株的挂膜及废水处理效果的比较
将5 株不同的白腐真菌接种至含载体的废水培养基中, 培养条件为pH 6. 0, 葡萄糖1. 0 g/ L, 酒石酸铵0. 2 g/ L, 其他成分同1. 3, 将黑液废水处理16 d, 实验结果见图1 和图2.

从图1 中可以看出, 黄孢原毛平革菌、侧耳菌和S22 菌株对黑液废水中木质素的降解率均在d 7 时达到较高值( 60%以上) , 其中侧耳菌和S22 菌株在d 4 时木质素降解率已分别达53%和54%. 随着处理时间的延长, 木质素降解率的提高不明显. 香菇菌对木质素的降解率虽然也很高(65%) , 但在d 10 时才达最高值; 变色栓菌的降解速率最慢, 在d 4 时木质素降解率仅为33%, d 13 时才达到最高值, 最高的木质素降解率只有49%.图2 表明, 对黑液废水COD 去除率较高的仍然是黄孢原毛平革菌、侧耳菌和S22 菌株, 其中S22 菌株在d 7 时COD 去除率最高, 达46%, 􀀂( COD) 可从4 560 mg/ L 降至2 462 mg/L. 其余两株均在d 10 时COD 去除率最高. 但处理时间的延长并没有导致COD 去除率的显著增大. 而香菇菌和变色栓菌对黑液废水COD 的去除率则较低, 分别为31% 和32%.以目视法比较载体上菌株的挂膜生长情况, 同样是黄孢原毛平革菌、侧耳菌和S22 菌株这3 种菌株的挂膜生长状况较好, 4～ 5 d 时已基本完成挂膜, 而香菇菌和变色栓菌的挂膜时间较长, 需7 d 以上. 这一现象与上述3 种菌株对黑液废水的良好的木质素降解能力和COD 去除能力相一致, 表明微生物的良好生长是取得有效的废水处理效果的先决条件.在其他条件都相同的情况下, 作不投加载体的试验, 比较挂膜生长与游离生长的生物量对黑液废水的处理效果. 实验结果表明, 在所采用的5 株白腐真菌中, 均以挂膜生物量的处理效果较好. 以黄孢原毛平革菌为例, 游离生物量对黑液废水中木质素的降解率和COD 去除率分别只有41%和30%, 而挂膜生物量对黑液废水中木质素的降解率和COD 去除率分别为62%和45%, 明显高于游离生物量的处理效果.综上所述, 黄孢原毛平革菌、侧耳菌和S22 菌株对黑液废水的适应能力较强, 对木质素的降解能力和COD 的去除能力都明显优于变色栓菌, 降解木质素和去除COD 的速率也显然优于变色栓菌. 香菇菌对木质素的降解能力虽然也较强, 但COD 去除率不高, 且降解木质素和去除COD 的速率比较缓慢。从废水处理技术工业化的角度考虑, 以黄孢原毛平革菌、
侧耳菌和S22 菌株处理造纸黑液废水较合适.

2. 2 􀀁 碳氮源浓度对挂膜和废水处理效果的影响

2. 2. 1 􀀁 碳源浓度的影响􀀁 􀀁
废水培养基中以酒石酸铵为氮源, 质量浓度保持0. 2 g/ L 不变, 以葡萄糖为碳源, 调节pH 为6. 0, 其它成分和培养条件见1. 3 及1. 4, 实验菌株为侧耳菌.研究不同葡萄糖浓度对挂膜和黑液废水处理效果的影响. 同时也考察了废水培养基中不添加碳氮源、只添加KH2PO4和Mg􀀁SO4#7H2O 以及任何营养成分都不添加这两种条件下侧耳菌对黑液废水的处理情况.

实验结果表明( 图3) , 葡萄糖质量浓度为1. 0 g/ L 和10. 0g / L 时木质素降解率大致相同, 在d 10 时, 木质素降解率分别为68%和67%, 木质素含量从920 mg/ L 分别降低至294 mg/L 和304 mg/ L. 但在d 7 时, 1. 0 g/ L 条件下已有65%的木质素降解, 而10. 0 g/ L 时木质素降解率为58%, 说明在1. 0 g/ L􀀁条件下不仅降解率高而且降解速率较快. 随后降解率的提高不甚明显. 葡萄糖浓度为20. 0 g/ L 和50. 0 g/ L 时, 木质素降解率明显下降. 同时注意到, 在不添加碳氮源的情况下, 有无机盐存在时木质素降解率可达58%, 没有无机盐时木质素降解率只有45%, 这一方面表明无机盐对木质素的降解起着重要作用, 另一方面也表明白腐真菌可以利用废水本身所含的某些物质生长并分泌木质素降解酶. 当仅仅不添加碳源( 0 g/ L 的情况) 时, 木质素降解率只低于1. 0 g/ L 和10. 0 g/ L 条件下的木质素降解率, 而比其他浓度条件下的木质素降解率都要高. 这说明白腐真菌虽然可以利用废水本身所含的某些物质生长, 但在废水中添加适量的碳源对于木质素降解率的提高是非常必要的, 而过多的碳源显然不利于木质素的有效降解.

COD 的去除情况见图4. 从图中可见, COD 去除率的变化趋势与木质素降解率类似. 葡萄糖浓度为1. 0 g/ L 时COD 去除率最高达45%, 􀀂( COD) 从4 580 mg / L 降低至2 519 mg/ L;葡萄糖浓度提高到10. 0 g/ L 时, COD 去除率虽有提高, 但只增加了3%, 提高的程度不大; 而当葡萄糖浓度增大到20. 0 g/L 和50. 0 g / L 时, COD 去除率则显著下降, 低于35%. 当不添加任何成分时, COD 虽有一定程度的去除, 但比其它条件下的COD 去除率都要低; 而一旦添加了无机盐( 不添加碳氮源) ,COD 去除率从29%提高到37%. 因此在COD 的去除过程中,无机盐是起了一定作用的. 据文献报道[ 3, 11] , 在木质素降解和纸浆漂白废水脱色的过程中, 木质素过氧化物酶和锰过氧化物酶是主要的木质素降解酶. 以香菇菌处理制浆厂废水时, 发现适量的碳源有利于菌丝生长, 但只在一定浓度范围内对COD的去除有效, 过量的碳源会影响木质素降解酶的活力, 从而影响废水的处理效果[ 12] . 在本实验中, 葡萄糖浓度控制在1. 0 g/L 即可, 过多无益.从挂膜生长的情况来看, 在葡萄糖浓度为1. 0 g / L 和10. 0g / L 的废水培养基中, 侧耳菌的挂膜情况明显优于其它条件下的膜生长情况, 目视观察在4～ 5 d 时基本完成挂膜. 在20. 0g / L 和50. 0 g/ L 的浓度条件下, 生物量较少, 导致挂膜量也较小. 在不添加碳氮源只有无机盐的废水中, 以及当不添加任何成分时, 生物量很小且挂膜也很少. 因此过量的碳源及不添加碳源显然都对生长不利; 无机盐的存在对菌丝的生长挂膜十分重要, 从而影响着木质素的降解和COD 的去除.

2. 2. 2 􀀁 氮源浓度的影响􀀁 􀀁
保持1. 0 g/ L 的葡萄糖浓度不变, 考察不同氮源( 酒石酸铵) 浓度对侧耳菌在废水中挂膜生长和对黑液废水的处理效果( pH 6. 0) , 其它成分和培养条件见1. 3 及1. 4.Kirk 等人研究表明[ 13] , 低氮能够促进黄孢原毛平革菌对木质素的降解, 高氮则抑制木质素降解. 氮源浓度对黑液废水中木质素的降解和COD 的去除的影响见图5 和图6.

由图可见, 酒石酸铵浓度的大小对黑液废水的处理效果有较大影响. 当不添加氮源时, 木质素降解率和COD 去除率分别为63%和35%; 随着酒石酸铵的浓度增大至0. 2 g/ L, 木质素降解率和COD 去除率分别增大至70%和48%, 木质素可从925 mg/ L 降为278 mg/ L,􀀂( COD) 可从4 570 mg/ L 降为2 376 mg/ L; 继续增大氮源浓度至2. 0 g/ L 时, 木质素降解率和COD 去除率均显著下降, 仅为34%和29%; 当酒石酸铵浓度增大到10. 0 g/ L 时, 木质素降解率仅为27%, COD 去除率也仅为21%. 由此可见, 适量添加氮源能够有效地提高侧耳菌对黑液废水的处理效果, 但过量的氮源可能会抑制木质素降解酶的分泌, 因而抑制侧耳菌对木质素的降解作用, 从而影响黑液废水的处理效果.侧耳菌在黑液废水中的挂膜生长情况与上述木质素降解情况基本一致, 在0 g/ L 和0. 2 g/ L 的氮源浓度下, 生物膜生长良好, 生长量大, 挂膜快, 4～ 5 d 时基本完成挂膜. 而在其它浓度条件下, 生物量较少, 挂膜量小. 因此选择0. 2 g/ L 的酒石酸铵浓度较适宜.在上述考察外加碳氮源影响的实验中, 随着葡萄糖和酒石酸铵浓度的增大, 黑液废水的初始COD 也相应增大, 但由于微生物在生长过程中是不断消耗碳氮源的, 因此难以将黑液本身的COD 与碳氮源所占的COD 区分开来. 故在本实验中仍以总COD 去除率来计算.

2. 3 􀀁 碱性条件对挂膜和废水处理效果的影响
由于造纸黑液的pH 值在12 以上, 因此以黄孢原毛平革菌、侧耳菌和S22 菌株为试验菌株, 研究在不同的碱性条件下( pH 值为7. 0～ 11. 0) 菌株的挂膜生长情况和对黑液废水的处理效果. 废水培养基中含1. 0 g/ L 的葡萄糖, 0. 2 g/ L 的酒石酸铵, 调节至不同的pH 值, 其它成分和培养条件见1. 3 及1. 4.

由图7 和图8 可见, 当废水培养基的pH 在7. 0～ 9. 0 范围内时, 黄孢原毛平革菌对黑液废水的处理效果最佳, 木质素降解率和COD 去除率分别可达78%( pH 9. 0) 和65%( pH 8. 0) .在pH 10. 0 和pH 11. 0 条件下, 则以S22 菌株对黑液废水的处理效果最好, 木质素降解率和COD 去除率分别可达84% ( pH10) 和69%( pH 10) , 木质素可从960 mg/ L 降为154 mg/ L, 􀀂( COD) 可从4 850 mg/ L 降为1 504 mg/ L. 有文献报道Ox ys􀀁p orus sp. 和Pl. chrysosp or ium 能够降解木质素, 它们的木质素降解率分别为70%和60%[ 14] , 均低于上述实验结果. 此结果表明, 这3 种菌株在较强的碱性环境中都能显著地降解木质素和去除COD, 同时挂膜生长的情况表明它们在碱性条件下均能生长挂膜. 但每种菌株生长的适宜pH 是不同的, 黄孢原毛平革菌和侧耳菌在pH 7. 0, pH 8. 0 和pH 9. 0 条件下生长挂膜比较好, pH 10. 0 和pH 11. 0 时次之。而S22 菌株在pH 8. 0～10. 0 范围内生长挂膜的情况差不多, pH 11. 0 时稍差一些. 由于造纸黑液废水是强碱性的, 因此这3 株白腐真菌能够在碱性环境中生长挂膜并降解木质素的独特优势, 为以生物技术治理造纸黑液的进一步研究奠定了基础. 白腐真菌在碱性环境中的这种生长与降解木质素的能力尚未见报道.

2. 4 􀀁 挂膜微生物对黑液废水的半连续化处理将黄孢原毛平革菌、侧耳菌和S22 菌株接种于新鲜的废水培养基中: 葡萄糖1. 0 g/ L, 酒石酸铵0. 2 g / L, 调节pH 值为7. 0, 其它成分见1. 3, 培养16 d, 完成第一次循环. 然后将挂膜载体投入第二批新鲜的废水培养基中, 在同样的条件下培养16 d, 如此循环3 次. 置换液的比例为100%.。

由表1 的实验结果可知, 在相同的培养条件下, 在第2 次和第3 次循环中, 木质素降解率和COD 去除率都逐渐增大, 表明生物膜可以较长时间地维持活性, 持续地处理废水. 随着新鲜培养基的更换, 脱落下来的老化生物膜和部分代谢产物被移去, 减少了后者对木质素降解酶的反馈抑制作用; 同时微生物不断地从新鲜的废水培养基中汲取营养, 继续生长, 维持生物膜的活性, 从而使黑液废水的处理效果得以稳定. 同时可见, 由于采用挂膜生长的方式, 易于实现半连续化处理. 与游离生长方式相比, 挂膜生物量在半连续化处理过程中具有生物量流失较少, 生物量的重复利用率高以及处理效果更佳的优势, 由此也为生物膜法连续处理黑液废水的可行性奠定了基础. 这方面的研究工作正在进行中.

3 􀀁 结论

3. 1 􀀁 在所考察的5 株白腐真菌中, 以黄孢原毛平革菌、侧耳菌和S22 菌株在20% 的黑液废水中的挂膜生长情况较好, 对废水中木质素的降解和COD 的去除能力较强.

3. 2 􀀁 在废水培养基中添加适量的碳源( 葡萄糖) 和氮源( 酒石酸铵) 有利于木质素的降解和COD 的去除, 但过量的碳氮源反而导致木质素降解率和COD 去除率的下降. 以侧耳菌为实验菌株, 在pH 6. 0 的废水中添加1. 0 g/ L 的葡萄糖和0. 2 g/ L的酒石酸铵处理效果最佳.

3. 3 􀀁 废水培养基中无机盐的存在对菌丝的生长十分重要, 有助于白腐真菌的新陈代谢, 更好地发挥白腐真菌降解酶作用机制; 适量的碳氮源对挂膜也是不可缺少的.

3. 4 􀀁 黄孢原毛平革菌、侧耳菌和S22 菌株在碱性较强的废水中也能生长挂膜, 其中S22 菌在pH 10. 0 时木质素降解率和COD 去除率最高, 分别达84%和69%. 表明白腐真菌具有对造纸黑液废水的适应能力以及显著降解废水中木素等污染物质的能力.

3. 5 􀀁 游离菌丝对黑液废水虽然也有一定的处理能力, 但在重复利用性方面具有一定的局限性, 容易流失, 因此不适合应用于黑液废水的半连续化或连续化处理过程. 而生物膜对黑液废水的半连续化处理结果则表明了生物膜的可持续利用性, 体现了生物膜的优越性, 同时也表明了生物膜法连续处理黑液废水的可行性. 虽然还有许多问题有待于进一步研究, 但本文的研究为造纸黑液废水的生物处理提供了一种新的技术和方法.（安徽大学生命科学学院）