类黄酮是一类常见的具有生物活性的植物次生代谢产物。药理学作用的研究表明，类黄酮物质具有清除体内自由基、抗癌、预防心血管疾病、抗菌、抗病毒等功效。绞股蓝含丰富的绞股蓝皂甙、黄酮、多糖、人体必需的氨基酸和多种微量元素，素有“南方人参"之美誉。其研究与开发一直引起国内外的广泛重视。目前绞股蓝中皂苷的测定方法通常为高效液相色谱法、分光光度法等。双水相体系萃取技术是一种高效而温和的生物分离新技术。该技术由于操作简便、能耗低、分离效率高、不会导致被分离物质的破坏和失活，目前广泛应用于生物化学、细胞生物学和生物化工等领域的产品分离与提取。但用于天然产物萃取分离报道极少。Li等研究了PEG1000 盐 水双水相体系萃取药物及其机理；PEG1500 PVP双水相体系萃取水杨酸和洛美沙星，PEG800-PVP双水相萃取稀土等。本文用PEG600和TritonX 100在(NH4)2SO4作用下形成双水相体系，萃取测定绞股蓝茶叶提取物中的芦丁。
1 实验部分
1.1 仪器试剂Cintra10紫外可见分光光度计(澳大利亚GBC公司)；UV 2102PCS紫外可见分光光度计(尤尼柯公司)；Waters600高效液相色谱仪(美国Waters公司)；pHS 3C型精密酸计(上海雷磁仪器厂)；三乐牌微波炉(WP650D，经改装)。聚乙二醇(PEG600，上海化学试剂公司)：体积分数50%水溶液；TritonX 100：体积分数30%水溶液；芦丁(Rutin，生化试剂，上海化学试剂公司)：0.50mg mL的甲醇溶液；0.4mol LBritton Robinson(B.R)缓冲溶液；其余试剂均为分析纯，实验用水为超纯水。
1.2 实验方法在10mL具塞比色管加入2.50mLPEG600，1.50mLTritonX 100及B.R缓冲溶液，一定量芦丁标准溶液，以水稀释至刻度，再加入一定量(NH4)2SO4固体，振荡溶解。静置分相后，移取上层表面活性剂相于比色管中，补加缓冲溶液，用水稀释至10.0mL后，以相应试剂空白为参比，1cm吸收皿中，在369nm处测定AE(萃取至表面活性剂相中芦丁的吸光度)或AP(加至表面活性剂相中芦丁的吸光度)；分别计算相应的质量浓度ρE和ρP，得到芦丁的萃取率(E%)。
2 结果与讨论
2.1 PEG600 TritonX 100 (NH4)2SO4 H2O双水相体系分相条件的选择2.1.1 PEG600与TritonX 100的体积比对分相的影响 固定两种表面活性剂总体积为4.00mL，加入(NH4)2SO42.5g时，分相相比R(V(PEG Triton)∶V(salt H2O))随V(PEG)∶V(TritonX 100)的增大而逐渐增大。考虑分相后相比R大小及表面活性剂相粘度适中，以便于操作又使样品有较大富集倍数，故选择V(PEG)∶V(TritonX 100)=2.50∶1.50为宜。
2.1.2 缓冲溶液pH和不同缓冲体系对分相的影响 取PEG6002.50mL、TritonX 1001.50mL，加入2.50g(NH4)2SO4时，在pH2.0～10.0的B.R缓冲溶液范围内，R保持不变，说明pH对分相无影响。在同样条件下测定HAc NaAc(pH4.0，5.0，6.0)和KH2PO4 Na2HPO4(pH4.0，5.0，6.0)缓冲体系中的分相相比，结果与B.R缓冲体系一致，说明缓冲体系种类对分相基本无影响。
2.1.3 盐用量和时间对分相的影响 在所选定的表面活性剂体积比和pH条件下，试验了(NH4)2SO4和(NH4)3PO4两种盐对分相的影响。当盐用量大于1.0g时均能分相。其中加入(NH4)3PO4后的分相相比很小且随盐用量的增加逐渐减小，下层出现不溶盐；而溶解度大的(NH4)2SO4分相速度快，效果更好，故选择(NH4)2SO4作为分相盐。当加入量为1.00～4.50g时，体系均能分成双水相，界面清晰，相比R随盐用量增加先增大而后又渐渐减小。实验时加入2 50g(NH4)2SO4。在此条件下考察分相时间发现，加入盐振荡溶解后，静置5～8min即可分相，约15min后，两相界面清晰，此后形成的双水相体系稳定，相比不变。
2.1.4 甲醇对分相的影响 考虑到所用标准芦丁为甲醇溶液，为使萃取芦丁时的相比和萃取率稳定，试验了甲醇的加入量对R的影响。图1表明，当甲醇加入量小于0.60mL时，R基本不变，而加入量大于0.60mL时则随甲醇用量的增加，R明显增大，甚至两相颠倒或不分相。因此，在萃取实验中必须控制加入芦丁标准的体积在0.60mL以内。
2.1.5 PEG相对分子质量对分相的影响 在选定的分相条件下，分别试验了PEG200、400、600、800、1000、1500和2000与TritonX 100形成双水相的分相情况，其中除PEG400和PEG2000与TritonX 100形成三相外，其余均可分为双水相，但PEG200体系的相比很小，PEG800体系相比偏大，PEG1500体系分相在同样时间内清晰程度稍差。实验采用PEG600与TrtonX 100形成组合表面活性剂双水相体系进行萃取。
2.2 芦丁在双水相体系中的萃取行为
2.2.1 工作曲线 pH6.0条件下，按实验方法在300～450nm内测定表面活性剂相中芦丁的吸光度。其最大吸收波长为369.0nm，绘制芦丁的工作曲线，其线性方程：A=-0.01985+0.02813ρ(μg mL)(n=8)，相关系数r=0.9999，芦丁质量浓度在0～90.0μg mL范围内符合比耳定律。
2.2.2 pH和缓冲体系对芦丁萃取率的影响 固定芦丁质量浓度为30.0μg mL时，在pH2 62～8 47B.R缓冲体系中芦丁的萃取率较高且稳定。但λmax随pH的增大而逐渐红移。结果见表1。这是由于pH增大时，芦丁分子中的酚羟基可形成-O-基团，产生p-π 超共轭作用，导致吸收向长波方向移动。在pH6.0HAc NaAc，K2HPO4 Na2HPO4，B.R缓冲体系中芦丁的萃取率分别为92.5%，96.7%和95.2%。表明3种缓冲溶液均能起到缓冲作用。但在pH6.0时，缓冲效果最好。实验选择2.00mLpH6.0B.R缓冲溶液控制pH。
2.2.3 (NH4)2SO4用量对芦丁萃取率的影响 从图2可知，ρ芦丁=30.0μg mL时，随(NH4)2SO4用量的增加，芦丁萃取率逐渐增大，盐量达2.5g以后，由于分相完全、相比适中，萃取率趋于稳定。萃取测定时加入2.5g(NH4)2SO4。
2.2.4 芦丁质量浓度对萃取率的影响 表2表明，在pH6.0B.R缓冲体系中，随着芦丁浓度的增大，芦丁的萃取率基本不变。而且在0～80.0μg mL芦丁浓度范围内呈线性萃取：AE=0.00171+0.02568ρE(n=8)，r=0.9998。
2.2.5 共存物质对芦丁萃取率的影响 对10.0μg mL芦丁的萃取率测定，以相对误差小于±5%时，400μg单宁酸、1000μg赖氨酸和1500μg精氨酸(均未做上限)不干扰芦丁的萃取测定。
2.3 绞股蓝茶叶中芦丁提取液的测定称取5.0g碾碎的绞股蓝茶叶，按料液比1∶32加入体积分数30%的乙醇水溶液。在20%功率档微波辐射15min，过滤除杂质，提取液经油浴减压旋转蒸发回收乙醇，所得浓缩液用蒸馏水定容，调节pH4.0控制一定流速通过DM 130大孔吸附树脂，再以体积分数70%乙醇洗脱后，浓缩干燥得样品。称取一定量样品加入甲醇，超声波处理约1min使其溶解，配成甲醇溶液，移取0.30mL溶液按实验方法萃取测定。样品测定结果与HPLC测定结果基本一致。结果见表3。