贴壁细胞培养步骤如下：

1、将含有冻存细胞的安瓿放入 37℃ 水浴中解冻。

2、用 70% 乙醇对安瓿的顶端进行消毒，打开安瓿，用吸管将细胞转移到含有 5 ml 起始培养基的 25 cm2 组织培养瓶中，轻轻摇动培养瓶，使细胞均匀分布于培养瓶中，将其放入 5% CO2 加湿培养箱中 37℃ 培养过夜。

3、吸出起始培养基，换成适当的维持培养基。将细胞放回 CO2 培养箱 37℃ 培养，每天检查细胞是否生长至汇片。

4、如果细胞生长至汇片，吸出培养基。

5、用 PBS 或胰酶/EDTA 清洗细胞，除去细胞上残留的血清，将洗液吸出。

6、用 37℃ 、适当体积的胰酶/EDTA 刚好覆盖单层细胞（如对于 25 cm2 培养瓶需要 0.3 ml）。消化 30～40 s（细胞应该分开），晃动培养瓶使细胞完全分开。

7、加入 1.4 ml 适当的维持培养基，用吸管来回吹打细胞悬液多次以打散细胞团（这些细胞用于传代）。

8、吸出 0.5 mL 的细胞悬液，将其加入到新的含有 30 ml 维持培养基 150 cm2 的组织培养瓶中。轻轻摇动培养瓶，使细胞均匀分布于培养瓶中，将其放入 CO2 培养箱中 37℃ 培养直到细胞生长至汇片（大约 1 周）。大约间隔一周用维持培养基进行 1:20 稀释传代以维持细胞生长。