式中，C0为柴油的初始浓度(mg · L-1)，Ct为反应时间为t时溶液中残余的柴油浓度(mg · L-1)，V是溶液体积(L)，M是改性竹炭颗粒的质量(g).

　　2.2.5 柴油及其降解产物分析

　　培养基中柴油含量分析步骤如下，向培养基、锥形瓶各加入10 mL正己烷作为萃取剂，手动萃取5 min，静置10 min移取上清液，利用UV-Vis在波长226.5 nm处测定吸光度，外标法定量柴油浓度.

　　柴油降解产物分析采用气相色谱-质谱联用法，样品的提取按照Vieira等(2007)报道的方法.以正己烷萃取反应前后含柴油的水溶液，振荡5 min，再添加定量的无水硫酸钠充分吸水，最后取适量装瓶测样，分别对反应前后溶液的去除效果进行分析.本研究采用的仪器是GC-MS(Agilent 6890-5975，美国)：DB-5石英毛细管柱(30 m×0. 25 mm×0. 25 μm);载气为He;流速为1 mL · min-1;柱温 60 ℃，恒温2 min，以12 ℃ · min-1升温至300 ℃，恒温5 min;进样口温度250 ℃，检测器温度300 ℃，总运行时间27 min(Morris et al., 2009).

　　2.2.6 SEM样品的制备与分析

　　取固定化菌体用无菌水洗涤3次，再使用2.5%戊二醛缓冲溶液(pH=7.2)浸泡0.5 h，用无菌水洗去残余的戊二醛后，加入不同浓度的乙醇溶液(30%、50%、70%、80%、90%和100%)逐级脱水，每个浓度脱水10 min，放入冷冻干燥器里干燥8 h. 再将制得的样品固定在导电胶上，进行等离子表面喷金. 采用日本Hitachi公司(型号为S-570)的扫描电子显微镜，观察样品表面的形貌与形态(Liu et al., 2012).

　　2.2.7 FTIR分析

　　含柴油水溶液处理前后的傅里叶变换红外光谱采用美国Thermo Corp公司的Nicolet5700红外光谱仪(波数范围为400～4000 cm-1，4 cm-1的光谱分辨率)进行分析，采用KBr法进行制样.

　　3 结果与讨论

　　3.1 固定化菌对柴油的去除效果

　　图 1为改性竹炭、固定化菌体与游离菌对柴油的去除情况. 从图中可知，改性竹炭在96 h内对柴油去除率达到22.6%，这表明改性竹炭对柴油具有一定的吸附效果，但吸附能力较弱. 游离菌对柴油去除率在96 h内达到
80.50%，此去除过程依靠的是微生物的降解能力. 三者中，固定化菌的处理效率最高，在培养第96 h时对柴油去除率达到86.35%，该去除过程包含了竹炭吸附效果和微生物降解两个途径. 产生这种现象的原因一方面可能是由于改性竹炭具有表面多孔的特性，除了对柴油具有一定的吸附效果外，还为微生物的生长提供了广阔的空间，提高了细菌的密度，促进了细菌对柴油的降解(Liu et al., 2012);另一方面，柴油中某些烃的组分经过生物降解之后会产生一些对微生物生长产生抑制的产物，这些有毒产物的积累会影响微生物细胞的生长繁殖，生物载体能够有效地屏蔽毒性物质对菌株的恶性侵害，增强其适应性(汪杰等，2010).对于所有处理，降解速率在前24 h内较快，之后开始变缓，这可能是由于随着微生物数量的急剧增长，营养物质被消耗，微生物开始衰亡，且柴油被分解后产生的一些物质也会对其产生毒害作用，使降解率降低.

 图 1 游离菌、改性竹炭、固定化菌在96 h内对柴油的去除效率

　　3.2 固定化菌对不同浓度柴油的去除

　　固定化菌对不同浓度柴油的去除如图 2所示.从图中可以看出，固定化菌对3种不同初始浓度的柴油的去除率随时间的变化趋势基本一致.实验前期由于水中柴油充分，微生物活性高，柴油的降解速率最快，8 h内对3种浓度柴油的去除率超过80%. 随着培养时间延长，柴油作为碳源被大量消耗，培养液中的营养物也逐渐减少，降解菌的生长速率降低. 另外，降解产物的不断积累对细菌的抑制作用也可能是去除率下降的一个影响因素(Wang et al., 2012). 培养96 h后，固定化菌对3种不同浓度的柴油的去除率分别达到84.8%(80 mg · L-1)、88.8%(120 mg · L-1)和90.5%(140 mg · L-1). 固定化菌对初始浓度为140 mg · L-1的柴油水溶液去除率要高于80 mg · L-1柴油水溶液，进一步说明固定化菌能够以柴油作为碳源，进而达到降解柴油的目的，同时表明固定化菌对高浓度柴油具有较强的耐受性.

 图 2 固定化菌在12 h内对不同初始浓度的柴油的降解情况

　　3.3 吸附-降解动力学分析

　　为了进一步研究固定化菌对不同浓度(80、120、140 mg · L-1)柴油的去除机理，用伪一级动力学模型(2)(Lin et al., 2013)和伪二级动力学模型(3)(Lin et al., 2013)来拟合固定化菌降解柴油溶液12 h内的吸附-降解动力学，结果如表 1所示.

表 1 柴油在不同初始浓度下的降解动力学拟合结果

　　式中，qt是t时柴油的去除量(mg · g-1)，qe是平衡时的柴油去除量(mg · g-1)，k1是伪一级动力学速率常数(min-1)，k2是伪二级动力学速率常数(g · mg-1 · min-1)，qe、k1和k2值都可以通过qt和t的图表关系获得.

　　动力学拟合所得相关参数如表 1所示，在所有浓度柴油水溶液中，伪二级动力学模型拟合效果(R2 >0.99)好于伪一级动力学模型(R2 <0.96). 当柴油的含量分别为80、120和140 mg · L-1时，其对应的去除速率常数k分别为0.1426、0.0993和0.0854 g · mg-1 · min-1，这一结果可以说明柴油的初始含量越高，其去除速率越慢. 根据伪二级模型计算的不同浓度柴油的qe理论值(7.01、10.07、11.70 mg · g-1)更接近于实验观测值(6.739、10.304、12.637 mg · g-1). 结果表明，固定化菌去除柴油更符合伪二级动力学模型，这说明多个过程控制固定化菌体对柴油的去除.改性竹炭表面丰富的官能团和内部微孔的结构，均对柴油吸附有所贡献.在柴油从水相向竹炭迁移的过程中，经历了水膜扩散、竹炭颗粒表面扩散和竹炭内部微孔扩散等多种过程.柴油分子进入改性竹炭载体后，负载在载体内外的微生物将总石油烃作为碳源和能源物质，在体内外酶的作用下将其代谢分解(Wang et al., 2015).

　　根据上述的吸附-降解动力学结果，提出一个可能的固定化菌吸附协同降解的过程机理，可分为两个阶段：在第一阶段，固定化载体的吸附发挥主要作用，导致柴油的浓度降低;第二阶段，固定化菌降解代谢起主导作用，这些假设将被后续的GC-MS及FTIR等分析手段进一步证实;最后阶段，两个过程的综合作用使溶液里的柴油浓度达到动态平衡.

　　3.4 SEM结果

　　固定前后的改性竹炭表面的SEM结果如图 3所示. 从图 3a可知，在固定化之前，改性竹炭表面积较大，且凹凸不平，分布着大小不一的微孔. 这种微孔结构能够保证氧气、营养元素的输送及降解底物的排放. 这充分说明改性竹炭是微生物固定化的理想载体，其所具有多孔结构能够为微生物提供足够的生长空间. 此外，微孔结构也可为污染物提供进入载体内部的通道(Wang et al., 2012). 从图 3b可见，在孔状结构中有微生物生长，且分布在改性竹炭载体上的菌落形态并不完全一致，有些细菌团簇在一起，有些则处于分散状态. 由此说明，竹炭固定细菌可能存在两种途径，包括菌体间的物理吸附及细菌与载体间的交联作用(Qiao et al., 2010).

 图 3 改性竹炭固定化菌前(a)、后(b)的电镜图 

　　3.5 FTIR结果

　　图 4是固定化菌去除柴油水溶液前后的FTIR谱图.由图 4可知，降解前柴油水溶液的红外谱图中，3850～3500 cm-1范围内存在的3733.9 cm-1及3454.4 cm-1吸收峰，这是由强烈的羟基伸缩振动引起的(Swiatkowski et al., 2004). 2970～2840 cm-1为饱和碳氢化合物的特征峰，系甲基、亚甲基和次甲基的伸缩振动和弯曲振动吸收峰.1572.1 cm-1处出现的强烈伸缩振动峰为苯环骨架振动产生(Cabal et al., 2009)，1470～1430 cm-1范围内的1448.6 cm-1吸收峰为C—CH3弯曲振动峰，在1250～1150 cm-1区内出现的1210 cm-1峰为支链烷烃的C—C骨架振动吸收峰.柴油降解后红外谱图中，在3495～3430 cm-1出现的3437.2 cm-1峰为芳香仲胺的伸缩振动峰，2924.4 cm-1附近的吸收峰为羧酸的特征峰，1410～1310 cm-1范围内的1407.8 cm-1峰为酯类及醇类的强烈伸缩振动峰.比较降解前后的柴油水溶液的红外图谱发现，固定化菌体系能够有效地处理柴油中的不同组分，经反应后，代谢产物中有羧酸类、酯类、醇类等物质产生.何良菊等(2004)研究表明，石油类物质在微生物的作用下，中间产物往往以脂肪酸类物质居多. 短链烷烃的亚末端氧化为醇和相应的脂肪酸(Forney et al., 1968);直链烷烃的微生物降解途径以单末端氧化和双末端氧化生成二元羧酸为主(McKenna et al., 1970);发生单末端氧化时，烷烃氧化为相应的醛和脂肪酸;而发生双末端氧化，则是烷烃被转化成二元羧酸(Scheller et al., 1998). 这表明柴油的降解过程中不仅有单末端氧化、次末端氧化，同时还有双末端氧化.

 图 4 改性竹炭固定化菌前(a)、后(b)的电镜图 

　　3.6 GC-MS分析结果

　　为了探究柴油的去除情况，分别对微生物降解前后的柴油水溶液进行GC-MS分析. 图 5分别是柴油、游离菌降解后及固定化菌去除后的GC-MS谱图.从图中可以看出，威尼斯不动杆菌可以高效的降解柴油各种长度的烷烃. 由图 5b可知，经过游离菌降解后，柴油中长链烷烃(C16～C30)几乎完全降解，对C11、C6、C8的降解率分别达到83.05%、59.54%、55.48%.烃类的降解主要依赖于微生物的降解能力，又受烃类自身性质所制约.Liu等(2011)认为饱和烃较不饱和烃更易降解，这就使得C16～C24范围内的烷烃具有好的降解性. 从图 5c中可以看出，在反应96 h后，固定化菌较游离菌对柴油的去除更为彻底，柴油内不同组分均得到有效地降解.可能是疏水性固定化载体不仅与底物之间存在着高亲和性，而且为降解菌的生长提供了良好的微环境，促使菌株更容易与底物接触并发生反应，从而加快降解速率(Hou et al., 2013). 柴油中部分烃的降解产物可能对微生物的生长繁殖产生抑制作用，而载体对有毒底物的扩散会产生一定的阻碍作用，使得固定化菌表面的实际毒物浓度降低，进而对细胞有一定的保护作用(Yamaguchi et al., 1999). Morris 等(2009)在对微生物降解后的柴油水溶液进行GC-MS分析时发现，在4 min左右产生了大量的乙酸、酮类、酯类、戊二醇等物质，这一结果与图 5b中色谱峰的结果较为相似.因此，结合FTIR结果我们推测，Acinetobacter venetianus对柴油的降解是单末端氧化、次末端短氧化、双末端氧化等多种氧化途径综合作用的结果.

 图 5 游离菌和固定化菌降解柴油溶液的GC-MS图(a.柴油溶液空白对照组; b.游离菌降解柴油溶液;c.固定化菌降解后的柴油溶液) 

　　4 结论

　　1)通过研究改性竹炭固定化Acinetobacter venetianus去除水体中的柴油，可知固定化菌对柴油的去除效果高于游离菌，对140 mg · L-1的柴油水溶液的去除率达到90.5%;而改性竹炭表面多孔的特性对柴油存在一定的吸附作用; 固定化菌对柴油的吸附协同降解过程拟合结果符合伪二级动力学，这表明油类分子首先被改性竹炭吸附，再被威尼斯不动杆菌降解.

　　2)通过对SEM结果分析，证实改性竹炭能够很好地固定Acinetobacter venetianus.结合FTIR和GC-MS结果推测，柴油经过威尼斯不动杆菌降解之后，部分组分转化为酮类、羧酸类，这表明在固定化菌在去除柴油不同组分的过程中存在着多种降解机制.