1 引言

　　生物法污水处理是被国内外广泛应用的技术，此方法具有处理彻底、有机物降解率高、二次污染小、能耗低和运行管理方便等优点，但由于水温影响到微生物的生长和繁殖，使得温度成为生物污水处理效率的限制因子(Namsivayam et al., 2011;Jin et al., 2005).我国绝大部分被污染的海洋、湖泊冬季平均温度多在4 ℃以下，因此在生物污水处理中温度是影响生物污水处理效果的一个重要因素.

　　低温微生物指生活在低温环境下的微生物.这类微生物可分为两类.一类是必须生活在低温条件下，在0 ℃可生长繁殖，最适温度不超过15 ℃，最高温度不超过20 ℃的微生物，称之为嗜冷菌(Psychrophiles);另一类是能在低温条件下生长，在0～5 ℃可生长繁殖，最高生长温度可达20 ℃以上的微生物称之为耐冷菌(Psychrotrophs)(辛秀明，1998;Whyte et al., 1996).

　　污水处理效率通常用污水中有机物的去除率表示，而化学需氧量(COD)是衡量水中有机物质含量多少的指标，其值越大，说明水体受有机物的污染越严重，因此，通常可以用 COD 的去除率表示污水处理效率的高低(Wu et al., 2011).污水生化处理的实质是微生物所产生的多种酶催化一系列生物氧化还原反应从而达到去除污水中有机物的目的.脱氢酶(DHA)能使被氧化的有机物氢原子活化并传递给特定的受氢体，因而其活性能反映处理工艺中活性微生物量及其对有机物的代谢能力(Yang et al., 2002).低温菌的冷适应机制之一是其体内参与代谢的酶在低温下仍具有高效催化活性.近年来，关于常温条件下COD的去除率与微生物的脱氢酶活性相互关系的研究很多(Park and Lee， 2005)，而有关5 ℃以下的低温环境的研究却很少，因此，寻找一株在低温和常温环境下同时具有高效降解性的耐冷菌对污水处理具有重大意义.本项研究从低温活性污泥中分离出适合低温污水处理的高效耐冷菌，将该菌进行分类鉴定，并通过对比该菌株在低温(4 ℃)和常温(25 ℃)条件下对污水中COD的去除率以及体系DHA活性，表明该菌株对低温环境条件下的污水处理具有潜在的应用价值

　　2 材料与方法

　　2.1 样品采集

　　活性污泥取自青岛李村河污水处理厂曝气池.

　　2.2 模拟生活污水

　　COD为800 mg · L-1的模拟生活污水(崔丽等，2007)：葡萄糖 0.1700 g，可溶性淀粉 0.1600 g，CH3COONa 0.2330 g，NH4Cl 0.0255 g，蛋白胨 0.1580 g，牛肉膏 0.0600 g，(NH4)2SO4 0.028 4 g，KH2PO4 0.0700 g，Na2CO3 0.0600 g，pH 5.5～6.0，去离子水1.0 L.

　　COD为400 mg · L-1的模拟生活污水：葡萄糖 0.0850 g，可溶性淀粉 0.0800 g，CH3COONa 0.1165 g，NH4Cl 0.0255 g，蛋白胨 0.0790 g，牛肉膏 0.0300 g，(NH4)2SO4 0.0284 g，KH2PO4 0.0700 g，Na2CO3 0.0600 g，pH 5.5～6.0，去离子水1.0 L.

　　2.3 主要仪器与试剂

　　电泳仪、PCR仪购自Bio-RAD公司，紫外可见分光光度计购自岛津公司，台式冷冻振荡器购自太仓华利达实验设备有限公司.

　　Taq聚合酶、pMD19-T载体、DNA Marker、T4连接酶、PCR产物纯化试剂盒购自上海生工生物工程技术服务有限公司，引物合成和DNA测序由南京金斯瑞生物技术有限公司完成，其他试剂为国产分析纯.

　　2.4 高效耐冷菌的筛选

　　将50 mL活性污泥样品放入灭菌后的装有小玻璃珠的250 mL锥形瓶内，加入50 mL无菌水，30 ℃100 r · min-1摇床振荡1 h，使活性污泥里的微生物充分释放出来.采用稀释涂布平板法，将处理后的活性污泥制成10-3、10-4、10-5三个浓度梯度的活性污泥稀释液，涂布到LB培养基上，4 ℃培养5～7 d，挑取具明显生长优势且形态、色泽不同的大型菌落，进行平板划线纯化，反复进行3次，同时用显微镜观察菌落纯度，直至获得纯培养.

　　将种子液按7%的接种量接入模拟生活污水(接种之前要将种子液离心，弃上清，后用等体积的无菌水重悬、离心、弃上清以洗去残留的LB液体培养基，重复洗3次即可，下同)，4 ℃摇床培养，150 r · min-1下培养96 h，装液量为每100 mL/250 mL三角瓶;发酵液经5000 r · min-1，25 min离心取上清液测定COD，计算COD的去除率，同时测定体系DHA活性.

　　2.5 高效耐冷菌的鉴定

　　参照文献对菌株进行形态观察和生理生化试验(东秀珠和蔡妙英，2001).另外对菌株进行16S rDNA鉴定，具体方法如下.直接用菌体作为模版，选用16S rDNA通用引物27f：(5′-AGAGTTTGATCCT GGCTCAG-3′)1492r：(5′-GGTTACCTTGTTACGAC TT-3′)，扩增体系(25 μL)：10×Taq buffer2.5 μL，Mg2+(25 mmol · l-1)2.0 μL，dNTP(2.5 mmol · l-1)2.0 μL，引物(25 pmol · μL -1)各0.5 μL，Taq酶 0.3 μL，ddH2O 17.2 μL.反应条件：94 ℃预变性5 min，94 ℃变性30 s，52 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，循环30次，72 ℃终末延伸10 min，10 ℃保温10 min.

　　PCR产物经回收试剂盒纯化，然后进行T-A克隆，挑取阳性克隆子送南京金斯瑞生物技术有限公司进行测序.测序结果提交NCBI 数据库中进行序列比对分析(Genbank序列登陆号KJ125513)，选取同源性较高的序列，利用MEGA5.2软件，基于邻接法(Neighbor Joining method)构建菌株系统发育进化树.

　　2.6 不同因素对高效耐冷菌处理污水的影响

　　2.6.1 运行时间对COD去除率的影响

　　装液量为100 mL污水/250 mL三角瓶，投加耐冷菌后分别于4 ℃、25 ℃、150 r · min-1振荡处理96 h，每隔12 h取1次样，培养物经5000 r · min-1，25 min离心取上清液测定COD，计算其在低温、常温下COD的去除率.

　　2.6.2 初始COD对COD去除率及体系DHA活性影响

　　7%的接种量将耐冷菌接种到初始COD分别为400 mg · L-1、800 mg · L-1的模拟生活污水中，分别于4 ℃、25 ℃摇床培养96 h，计算其在低温、常温下COD的去除率及DHA活性.

　　2.6.3 接种量对COD去除率及体系DHA活性影响

　　分别以3%、5%、7%、10%的比例投加耐冷菌，分别于4 ℃、25 ℃摇床培养96 h，计算其在低温、常温下COD的去除率及DHA活性.

　　2.6.4 初始pH对COD去除率及体系DHA活性影响

　　使用1 mol · L-1的H2SO4和1 mol · L-1的NaOH将模拟污水pH值分别调为5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，投加耐冷菌后分别于4 ℃、25 ℃摇床培养96 h，计算其在低温、常温下COD的去除率及DHA活性.

　　2.7 测定项目及分析方法

　　COD：重铬酸钾法;DHA活性：氯化三苯基四氮唑(TTC)比色法(齐鲁青等，2012; Li et al., 2012);测定温度为污水降解温度;实验进行3次重复，每次取3个重复样，实验数据取3个重复样的平均值，并进行标准差分析(图 3～图 6中误差线表示标准差).单因素和多因素方差分析(ANOVA)在SPSS16.0完成.

　　3 结果

　　3.1 高效耐冷菌的筛选

　　4 ℃条件下，从LB培养基分离到5株菌落形态大、生长速度快的耐冷菌，依次命名为DW1～DW5.

　　模拟污水实验结果表明，5株菌在低温时对COD的去除率在30.4%～67.7%之间，其中菌株DW1的脱氢酶活性(以TF计，下同)和COD的去除率最高，其余的4株细菌的去除率都低于55.0%(表 1).由此可见菌株DW1对污水中COD的去除效果较好，因此选择菌株DW1作为研究对象，用于后续研究.

表1 耐冷菌对COD的去除率及其脱氢酶活性

　　3.2 菌株DW1的鉴定

　　菌株DW1在LB培养基上的菌落及菌体形态见图 1.菌株DW1菌落呈浅粉红色，圆形、湿润，边缘整齐.

 图 1 DW1的菌落形态(a)以及光镜下的菌体形态(b)

　　通过对菌株DW1进行16S rDNA扩增、克隆测序后得到大小为1498 bp的序列，系统发育树结果显示(见图 2)DW1与Pseudomonas gessardii (NR_024928.1)聚于同一个分支上，序列相似性达99%，结合形态观察和生理生化特性(表 2)，DW1初步鉴定为Pseudomonas sp..

 图 2 基于16S rDNA序列菌株DW1的系统发育进化树 

 表2 菌株DW1部分生理生化特性

　　3.3 菌株DW1处理模拟污水的影响因素

　　3.3.1 运行时间对COD去除率的影响

　　低温条件下，菌株DW1对污水中COD的去除率随着运行时间的延长增加(图 3)，运行60 h后，COD的去除率趋于稳定，达到67%;常温条件下，菌株DW1对污水中COD的去除率先迅速升高，运行24 h去除率达到最大值73%，后出现小幅下降，最后趋于稳定.通过菌株DW1在低温和常温对污水中COD去除率的比较，运行36 h内，菌株DW1在常温对污水中COD的去除率明显高于低温;36 h后两者趋于稳定，且在常温对污水中COD的去除率略高于低温.

 图 3 运行时间对COD去除率的影响 

　　3.3.2 初始COD对COD去除率及体系DHA活性影响

　　菌株DW1对初始 COD 高浓度污水COD的去除率较高，COD的去除率与DHA活性正相关(图 4).在低温和常温条件下，去除率分别为69.8%和76.2%; 同样高浓度污水DHA酶活性也较高，在低温和常温分别为9.89 μg · mL-1 · h-1和12.13 μg · mL-1 · h-1. 因此，本研究中菌株DW1较适合初始 COD 负荷较高的污水处理.

 图 4 初始COD对COD去除率及DHA活性的影响(注：不同小写字母表示同一温度下不同处理的COD去除率的差异显著(p<0.05)，不同大写字母表示同一温度下不同处理的COD去除率的差异极显著(p<0.01)，下同) 

　　3.3.3 接种量对COD去除率及体系DHA活性影响

　　低温时，污水中COD去除率在65%左右，其中接种量为7%时最高，为69.9%(图 5)，同时DHA活性介于6.5～11.0 μg · mL-1 · h-1之间，接种量为3%时，DHA活性最高，接种量为5%、7%时次之，接种量为10%时，DHA活性最低.常温时，污水中COD去除率在75%左右，维持在较高水平，DHA活性介于8.3～15.2 μg · mL-1 · h-1之间，接种量为3%时，DHA活性最高，接种量为5%、7%时次之，接种量为10%时，DHA活性最低.

　　菌株DW1在接种量为7%时，COD的去除率最高，而接种量为3%时，DHA活性最高.推测原因为接种量为3%时，运行96 h细菌仍然处于对数期，DHA活性最高，但是由于细菌未达到最大生长量，因此，COD去除率并未达到最高;接种量为5%时，运行96 h细菌处于稳定期，此时COD去除率达到最大.接种量为10%时，运行96 h细菌处于衰亡期，因此，DHA活性和COD去除率均处于最低状态.

 图 5 接种量对COD去除率及DHA活性的影响 

　　3.3.4 初始pH对COD去除率及体系DHA活性影响

　　如图，pH对菌株的降解效能有明显的影响.低温时，污水pH值为7.0时，污水中COD去除率以及DHA活性最高，分别为71.2%、11.35 μg · mL-1 · h-1，pH为6.0、8.0时，COD去除率以及DHA活性次之，pH为5.0、9.0时，体系中COD去除率和DHA活性明显降低，污水处理效果最差(图 6).常温时，污水中COD去除率和DHA活性的变化趋势与低温相同，pH为7.0时，COD去除率和DHA活性最高，分别为78.8%和15.11 μg · mL-1 · h-1;可见菌株DW1较适合初始pH为7.0的污水处理.

　　4 讨论

　　目前纯培养微生物在低温条件下对含有多种碳源的模拟污水COD的去除率都较低.姜安玺等(2002)采用耐冷复合菌群处理低温生活污水，CODMn由单一菌群35%的去除率提高到复合菌群89%.徐成斌等(2014)分离得到一株以柴油为碳源的降解菌株Q21，该菌在15 ℃条件下运行72 h时对柴油的降解率为71.5%.单一菌株对COD的去除率往往比混合菌群的低，原因是温度在很大程度上影响着微生物的生理活动，对微生物个体的生长、繁殖、新陈代谢及种群分布和种群数量起着决定作用，从而影响了整个污水处理效率.混合菌群中微生物的种类较多，不同的微生物最适的碳源不同，因此在处理含有多种碳源的模拟污水时COD的去除率相对较高.本研究筛选出的菌株DW1在4 ℃条件下对含有多种碳源的模拟污水COD的去除率高达67.7%，同时，该菌在4 ℃和25 ℃条件下均具有较高的脱氢酶活性.

　　假单胞菌对低温污水中的有机物具有高效降解率.贲岳等(2008)从4 ℃生活污水处理系统中筛选出 6 株耐冷菌，该混合菌群对中、低温污水COD 的去除率可分别达到 80.9%和73.4%，其中一株为假单胞菌;徐巧等(2010)从土壤中筛选出一株高效耐冷菌黄假单胞菌，该菌株在5 ℃下对以葡萄糖为唯一碳源的模拟污水COD的去除率在90%以上.

　　如图 3所示菌株DW1在低温时COD去除率随着时间的增加而增加，96 h达到最高67%;但是在常温时COD去除率在培养 24 h 达到最高，73%，在36 h时略有下降，推测可能是运行36h时，菌种微生物发生了自溶现象，导致 COD去除率有所降低.随后，菌株DW1对COD去除率达到稳定状态.导致菌株DW1菌体自溶的原因可能有以下两个(李雪芝等，2005)：①随着时间的推移菌株本身对废水污染物的降解能力变得较差，而时间的延长会致使吸附到菌体上的物质脱吸，或由于不适应环境而死亡的菌体自溶或菌株的分泌物所致;②微生物对碳源不断利用，某种碳源的消失会导致微生物的不适应，出现部分菌体自溶，随着微生物逐渐适应环境，COD去除率也开始升高.

　　培养时间是影响COD去除率的重要影响因子.周围等(2012)分离筛选到一株具有高效降解苯环化合物的菌株PM8，30 ℃条件下，菌株PM8在36 h时对酒厂废水CODCr去除率较低(<55%)，72 h时菌株PM8对酒厂废水COD去除率为83.68%，接近于国家对污水排放的三级排放标准;黄华(2012)通过驯化培养得到降解黄药生产废水的混合细菌，该混合降解菌在30 ℃时对配制丁基黄药模拟废水、0#柴油、药剂厂黄药车间废水中CODCr去除率随着时间延长而增加，80 h时对配制丁基黄药模拟废水、0#柴油CODCr去除率分别是70%、35%，10 d后对药剂厂黄药车间废水中CODcr去除率为78%.本实验分离到的菌株DW1在低温和常温条件下，对COD为800 mg · L-1的多种碳源模拟污水COD去除率分别达到67%、73%，去除效果明显好于国内报道的COD降解菌株.

　　菌株DW1适合初始 COD 负荷较高的污水处理.原因可能是当进水中COD浓度较高时，污水处理系统中的营养水平会直接影响微生物的代谢，营养水平较高时，能保证微生物正常增殖使生物量增多，高的生物量进而使DHA活性更高，对有机物的降解率增大(Li et al., 2007).因此，菌株DW1对高浓度有机污水具有一定的应用前景.同时，COD的去除率与DHA活性正相关，原因是废水生化处理的实质是微生物所产生的多种酶催化一系列生物氧化还原反应从而达到去除污水中有机物的目的，其中，DHA能使被氧化的有机物氢原子活化并传递给特定的受氢体，因而其活性能反映处理工艺中活性微生物量及其对有机物的代谢能力(Margesin and Schinner， 1997).

　　该菌株适合处理中性污水.pH影响COD 的去除率主要是因为pH的改变影响了DHA的活性，而pH影响酶活力的原因可能有以下几个方面：过酸或过碱可以使酶的空间结构破坏，引起酶构象的改变，酶活性的丧失;当pH改变不很剧烈时，酶虽未变性，但活力受到影响;pH能够影响维持酶分子空间结构的有关基团解离，从而影响酶活性部位的构象，进而影响酶的活性(Dutta and Banecrjee， 2006).